Q:這種直接PCR試劑盒，擴增產(chǎn)物可以做哪些實(shí)驗

A:PCR的產(chǎn)物可以通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳和EB染色進(jìn)行分析，進(jìn)行下游的常規操作，例如限制性酶切、DNA測序、dHPLC分析等

Q:適用哪些樣本

A:嫩葉片組織、植物葉片、種子等

Q:樣品處理需要多久

A:10min內完成模板制備

Q:操作流程、實(shí)驗步驟等與常規檢測方法有多少區別

A:除了無(wú)需進(jìn)行DNA抽提，其他手段兼容。

Q:樣品如何處理

A:用槍頭戳取少量嫩葉片直接PCR，或者把微量的樣品（例如剪切成3mm的葉片）加入40ul裂解液A中，75℃煮10min，再添加40ul裂解液B混勻。取1-2.5ul（2-5%總反應體積）含有植物DNA的裂解液加入PCR反應體系作為模板

Q:樣品處理后如何保存

A:可-20°儲存

Q:反應體系

A:以40ul體系示例（20-50ul/reaction），在微量離心管中加入以下各種成分

Q:我的樣本是嫩葉片如何預處理

A:對于新鮮嫩葉片（例如擬南芥或者多數雙子葉植物的新鮮嫩葉片），可以不需預處理，用槍頭戳取嫩葉片直接加入PCR反應體系反應

Q:我的樣品較難處理，DNA不易抽提

A:部分難處理樣品，可以加入裂解液后碾磨，再煮沸處理

Q:我的樣品為新鮮的植物汁液，是否需要預處理

A:豆漿、植物果汁或者新鮮植物汁液可以直接PCR

Q:PCR反應模板

A:需要足夠的模板（100個(gè)以上拷貝）

Q:裂解液使用量是否有要求

A:聚合酶可以耐受最高10%（V/V）的裂解液，過(guò)量裂解液會(huì )對PCR反應產(chǎn)生抑制并對下游產(chǎn)物分析產(chǎn)生不利影響，大多數情況加入2-5%（V/V）植物裂解液可以完成PCR反應

Q:如何確認加入模板的最佳范圍

A:初次實(shí)驗，建議加入1%、2.5%和5%（V/V）植物裂解液或者植物汁液

Q:dNTP不穩定

A:dNTP容易失效，反應為陰性時(shí)，建議增加dNTP用量，或者更換新鮮制備的dNTP

Q:PCR反應參數設置

A:依據擴增產(chǎn)物而定，以2kb的擴增產(chǎn)物為例：94℃  4min，35 cycles（94℃ 30 sec，55℃ 30 sec，72℃ 1 min），72℃ 5 min，4℃ soak。

Q:片段大?。?kb

A:擴增1kb以下片段，30 sec延伸即可；可用兩步擴增法（引物長(cháng)度22-25bp，68℃退火延伸）