Q:一管式RT-PCR與傳統兩步法區別

A:7Sea-One Tube RT-PCR（一管式RT-PCR）區別于傳統的兩步法（逆轉錄和PCR擴增分兩步完成），RNA模板逆轉錄和cDNA擴增在一個(gè)管內完成，大大降低了污染風(fēng)險、縮短了分析時(shí)間并且提高了反應的重復性。

Q:擴增產(chǎn)物可以做哪些實(shí)驗

A:產(chǎn)物可以通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳和EB染色進(jìn)行分析，進(jìn)行下游的常規操作，例如限制性酶切、連接、DNA測序、dHPLC分析；或者采用定量PCR儀進(jìn)行qRT-PCR進(jìn)行在線(xiàn)分析。

Q:試劑盒可以應用哪些領(lǐng)域

A:1、cDNA克?。ㄆ蕉诉B接、限制性酶切、瓊脂糖凝膠電泳/EB染色、熒光毛細管電泳、DNA測序等）；2、特別適合RNA的qRT-PCR分析；3、RNA病毒或者RNA樣品的定量分析

Q:保真性如何

A:DNA聚合酶選用熱啟動(dòng)KOD，保真性比taq高20倍以上（產(chǎn)物適合平端連接）

Q:反應體系

A:以10ul體系為例，在微量離心管中加入以下各種成分

Q:滅菌

A:實(shí)驗中盡可能使用一次性的滅菌塑料制品，玻璃容器應用0.1% DEPC在37℃處理過(guò)夜，并且高壓滅菌處理，所有的水應該用0.1% DEPC 37℃處理過(guò)夜并滅菌

Q:引物用量

A:建議引物用量為終濃度0.2-0.6uM

Q:初次實(shí)驗，如何設置RNA模板梯度

A:例如100ng、10ng、1ng、0.1ng、0.02ng總RNA

Q:陽(yáng)性對照

A:建議每組反應用內參基因做陽(yáng)性對照質(zhì)控

Q:反應為陰性

A:dNTP容易失效，反應為陰性時(shí)，建議另外添加0.4mM dNTP

Q:Rnase inhibitor

A:RI可以有效防止RNA降解，并大大提高反應的重復性，建議加入終濃度0.5-1U/ul的RI，特別是微量RNA樣本分析，加入RI的效果非常明顯

Q:PCR反應循環(huán)示例

A:典型的一步法RT-PCR，包括第一階段的逆轉錄反應程序設置和第二階段的PCR擴增反應，例如（該例子為擴增400bp片段）

Q:長(cháng)片段

A:擴增長(cháng)片段可適當延長(cháng)逆轉錄時(shí)間（15-25min）和DNA延伸時(shí)間（1kb/min）

Q:延伸溫度

A:延伸溫度可以設定為52-72℃間，選用68℃延伸溫度，可以較好發(fā)揮KOD活性

Q:擴增低豐度模板

A:建議用45個(gè)循環(huán)