Q:拉到空的eGFP蛋白，出現非特異性吸附，怎么解決？
A：防止非特異性吸附，建議洗滌時(shí)加：加500mM Nacl、1%triton
Q：實(shí)驗后剩余的珠子沉淀下來(lái)不方便吸取，如何溶解？
A：用下游的裂解液 或者是 500mM Nacl、1% triton洗滌吹打都可以
Q：貼壁細胞如何裂解
A：取10cm細胞培養皿中的貼壁細胞，吸除細胞培養液，PBS洗滌兩次，然后加入500微升至2毫升細胞裂解液裂解細胞（如RIPA）；具體的裂解方法，應參考不同裂解液的詳細使用方法
Q：組織樣品如何裂解
A：對于組織樣品，參考貼壁細胞使用裂解液的比例進(jìn)行裂解；具體的裂解方法，應參考不同裂解液的詳細使用方法
Q：懸浮細胞如何裂解
A：取懸浮細胞，離心收集細胞后，PBS洗滌一次，然后參考貼壁細胞的裂解方法進(jìn)行裂解；具體的裂解方法，應參考不同裂解液的詳細使用方法
Q：結合能力是多少
A：1ml結合25mg蛋白（1ml protein A+G可以結合25mg human IgG）
Q：不同量的細胞，裂解方法一樣嗎
A：不同量的細胞，應選用適當裂解液的用量進(jìn)行裂解
Q：裂解的是動(dòng)物細胞，不是組織，是否用中等強度的RIPA
A：推薦使用sds裂解液，TNE裂解液，含有NP-40 ，EDTA，Tris等，方便好用，比RIPA溫和一些。
Q：細胞裂解液RIPA是否分強、中、弱？如果與全能核酸酶一起使用，同時(shí)加入嗎
A：ripa分強中弱，可以和全能核酸酶一起使用，但chip實(shí)驗一般用裂解能力更強的sds裂解液，（10^6細胞推薦用100ul-200ul裂解液）
Q：裂解獲得的蛋白樣品濃度過(guò)高，怎么辦
A：如果裂解獲得的蛋白樣品濃度過(guò)高，可以用裂解液或PBS適當稀釋
Q：裂解獲得的蛋白樣品濃度過(guò)低，怎么辦
A：如果蛋白樣品濃度過(guò)低，在以后的裂解過(guò)程中宜適當減少裂解液的用量
Q：蛋白樣品很粘稠，超聲后略有好轉，但雜帶很多，背景高
A：建議在細胞處理時(shí)加入全能核酸酶Benzonase Nuclease，降低背景，保障實(shí)驗的可重復性。
Q：如何去除非特異性結合
A：1. 取0.2-1mL蛋白樣品，蛋白量約為0.2-1mg，加入約1ug和免疫沉淀時(shí)使用的IgG 種屬相同的普通IgG和20uL充分重懸的Protein A+G Sepharose，4℃緩慢搖動(dòng)30分鐘至2小時(shí)。
2. 2500rpm(約1000g)離心5分鐘，取上清用于后續的免疫沉淀。
通過(guò)和 normal IgG和Protein A+G Sepharose的孵育，可以充分降低非特異性的結合，降低背景。
Q：種屬相同的IgG是什么
A：所謂種屬相同的IgG是指，假如后續免疫沉淀時(shí)用的是小鼠IgG，則在本步驟中可以加入normal mouse IgG，如無(wú)normal IgG可以加入其它不影響后續檢測的其它mouse IgG類(lèi)型的抗體
Q：一抗加多少
A：加入0.5-2ug 用于免疫沉淀的一抗，4℃緩慢搖動(dòng)過(guò)夜
Q：Protein A+G懸液是否為：TBS溶液？我們的懸液是否可直接用于實(shí)驗？還是要先洗Beads？
A：不是TBS，是20%乙醇，實(shí)驗前要先用PBS洗
Q：我們的Protein AG重懸在20%乙醇中，使用前怎么處理
A：用多少取多少再處理，例如用一次，20ul用PBS沖洗后，如果做的是IP實(shí)驗，那可以直接做后續的實(shí)驗，不需要再用PBS重懸
Q：Protein A+G Sepharose每次加入多少
A：加入10-20uL充分重懸的Protein A+G Sepharose，4℃緩慢搖動(dòng)1-3個(gè)小時(shí)。
☆注意：10-20uL Protein A+G Sepharose，即20-40uL50%充分重懸的Protein A+G Sepharose。
Q：一般1ug的抗體，用多少sepharose
A：1ug抗體，建議用10-20ul的sepharose（也就是20-40ul 50%重懸的溶液），我們的sepharose是保存在酒精中的，使用前要先用PBS洗的
Q：吸除上清時(shí)離心條件
A：2500rpm(約1000g)離心5分鐘，或瞬時(shí)高速離心
Q：吸除上清時(shí)吸到一點(diǎn)Protein A+G Sepharose，有沒(méi)有影響
A：寧可殘留少量上清，也不能吸掉Protein A+G Sepharose。
Q：用什么洗滌沉淀
A：用準備蛋白樣品時(shí)的裂解液或PBS洗滌沉淀5次
Q：洗滌沉淀用裂解液用量推薦多少
A：裂解液或PBS的用量每次為0.5-1毫升
Q：洗滌時(shí)離心條件
A：洗滌時(shí)離心條件和吸除上清離心條件一樣，即：2500rpm(約1000g)離心5分鐘，或瞬時(shí)高速離心
Q：離心洗滌后是否要去除上清
A：完成最后一次洗滌后，去除上清
Q：如何分離出樣品
A：加入20-50uL 1xSDS-PAGE電泳上樣緩沖液，震蕩重懸沉淀，瞬時(shí)高速離心把樣品離心至管底
Q：樣品離心至管底后如何處理
A：沸水浴處理3-5分鐘，取部分或全部樣品用于SDS-PAGE電泳
Q：暫時(shí)不用的樣品如何保存
A：暫時(shí)不用的樣品可以-20℃保存
Q：免疫沉淀適用什么樣品
A：普通的免疫沉淀雖然可以使用凍存的蛋白樣品，但推薦用新鮮的蛋白樣品為佳。
Q：免疫共沉淀適用什么樣品
A：免疫共沉淀(Co-IP)通常必須使用未經(jīng)凍存的新鮮蛋白樣品。
Q：免疫共沉淀實(shí)驗方法
A：與免疫沉淀方法相同
Q：免疫共沉淀實(shí)驗過(guò)程中，細胞裂解時(shí)是否可以加入benzonase
A：推薦在細胞裂解時(shí)加入全能核酸酶Benzonase Nuclease（貨號RPE002），降低背景，保障實(shí)驗的可重復性。
Q：如何保存
A：常溫運輸； 4℃保存，兩年有效。
Q：能否冷凍保存Protein A+G Sepharose
A：請勿冷凍保存產(chǎn)品
Q：未混合均勻
A：Protein A+G Sepharose Beads使用前要充分顛倒若干次，使Sepharose混合均勻
Q：能否常溫實(shí)驗
A：所有步驟中，蛋白樣品 在4℃或冰上操作
Q：可重復做多少次/是否可回收
A：可重復6-10次，避免純化不同抗體而產(chǎn)生交叉反應
同樣pull-down實(shí)驗，每次用量10-50uL，不推薦回收。如果用量大，每次0.5mL以上，可以pH2.5洗脫結合的抗體后，膠回收（用50mM NaOH洗滌，PBS沖洗后，保存在4度20%乙醇里）。
Q：所有蛋白樣品需要在4°C或冰上操作的原因？
A：避免蛋白變性
Q：在使用Protein A+G Sepharose Beads 時(shí)，怎么達到去除非特異性吸附的最佳效果？
A：可以通過(guò)更改NaCl的濃度以及去垢劑的比例，例如，針對單純的免疫沉淀而非免疫共沉淀實(shí)驗或者雖然是進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗，但蛋白質(zhì)之間的結合比較牢靠，可以考慮使用低濃度（0.2-0.5%）的SDS洗滌抗體-sepharose beads復合物，這樣可以去除絕大部分非特異性相互作用。
Q：IP的實(shí)驗步驟中，最后都沒(méi)有將兩個(gè)蛋白質(zhì)分開(kāi)的步驟，難道是在前面的步驟中相結合的兩個(gè)蛋白質(zhì)自己已經(jīng)分開(kāi)了嗎？
A：上樣時(shí)要加loading buffer，煮沸。這時(shí)所有蛋白都變性，自然就分開(kāi)了。也有人先將蛋白洗下來(lái)再電泳
Q：經(jīng)?？吹降鞍踪|(zhì)免疫共沉淀后行westernblot,我想問(wèn)什么時(shí)候需要作免疫共沉淀？為什么不直接進(jìn)行westernblot 呢？
A：通常，免疫共沉淀，是檢測可溶性蛋白的步驟之一，而不是最終的方法。因為沉淀的蛋白，還需要進(jìn)行進(jìn)一步的檢測。而后續的步驟大凡使用免疫印跡的方法去完成。如果做質(zhì)譜分析，一般還要進(jìn)一步用聚丙烯酰胺凝膠電泳純化后回收。由于采用了免疫學(xué)的方法沉淀目的蛋白，使之蛋白的檢測帶有強烈的目的性。 免疫共沉淀純化蛋白的質(zhì)量，與抗體化珠子（Beads）的質(zhì)量和洗滌緩沖液的質(zhì)量及其洗滌的方法
Q：當目的蛋白的大小接近重鏈或者輕鏈分子時(shí)，重鏈或者輕鏈分子的WB信號常常由于信號過(guò)強而導致影響對目的蛋白的WB結果判斷。這該如何避免？
A：針對上述情況，通常有二種解決辦法：
1． 選擇不同種屬的抗體分別進(jìn)行免疫沉淀實(shí)驗和WB實(shí)驗，這樣再選擇一個(gè)種屬交叉反應比較弱或者無(wú)種屬交叉反應的二抗進(jìn)行WB實(shí)驗，就可以大大減弱重鏈和輕鏈分子的WB信號。
2． 使用交聯(lián)劑將抗體和Protein A+G beads交聯(lián)，然后通過(guò)添加不含巰基乙醇的加樣緩沖液處理目的蛋白-抗體-sepharose beads復合物，最后離心去除抗體-sepharose beads復合物，上清中只留下目的蛋白。
Q：能否做染色質(zhì)（染色體）免疫共沉淀實(shí)驗
A：能
Q：是否BSA預封閉處理
A：pull-down實(shí)驗，一般不推薦BSA封閉。一般在實(shí)驗中發(fā)現非特異吸附現象很?chē)乐厥?，才考慮加入BSA。
Q：是否針對任何實(shí)驗，Protein A+G均可替代Protein A或Protein G？
A：是的
Q：A+G與A或G相比優(yōu)勢是？
A：protein a+g比protein a或protein g適合于免疫沉淀更多種類(lèi)的抗體
Q：條帶淡可能原因？解決方法
A：1）最簡(jiǎn)單方法，增加實(shí)驗樣品的量和濃度。每毫升ProteinAG可以吸附20mg以上抗體，一般pulldown實(shí)驗，proteinAG都是過(guò)量的。
2）延長(cháng)proteinAG和樣品的混合震蕩時(shí)間（例如4度過(guò)夜），保證proteinAG和樣品的充分接觸。
Q：sepharose對人或鼠lgG的親和力如何
A：人的親和力是1ml結合20mg以上 IgG，鼠大概3mg左右
Q：一次性收集的細胞，大約0.5ML，需要加多少裂解液（RIPA+PMSF）
A： IP實(shí)驗時(shí)候，推薦消化下來(lái)細胞后，直接用RIPA裂解液裂解。根據目的蛋白質(zhì)的表達位置（細胞質(zhì)、細胞核還是細胞器）可以選擇抽提細胞亞組分。選擇合適的強度的裂解液。蛋白酶抑制劑推薦用cocktail。
Q：是否需要將總蛋白用非免疫血清和Sepharose反應，去除非特異性結合蛋白，再來(lái)加抗體，接著(zhù)加Sepharose？
A： 推薦用用非免疫血清preclear樣品，降低非特異性產(chǎn)生的假陽(yáng)性。
Q：如果需要先處理非特異性結合蛋白，那么非免疫血清，就是陰性對照的抗體（正常鼠IgG）嗎？
A：是的。
Q：未檢測到目得蛋白或蛋白很少
A：1、提高樣品量；2、降低buffer的離子強度。
Q：目的蛋白高背景
A：蛋白質(zhì)背景高1、首先確認電泳體系、染色體系、WB體系沒(méi)有錯誤；2、提高buffer的離子輕度；3、實(shí)驗中增加preclear去掉非特異性吸附問(wèn)題。
Q：能否用高濃度的變性劑
A：不推薦使用高濃度的變性劑尤其是強變性劑，容易使蛋白質(zhì)變性造成實(shí)驗失敗。
Q：如何使用對照抗體
A：對照抗體選擇同種未免疫的動(dòng)物提取的血清中純化的抗體，各種亞型都有商品化產(chǎn)品。
Q：能否幾種抗體共同使用
A：幾種抗體同時(shí)使用，可以但是不推薦。
Q：?jiǎn)慰寺】贵w的作用
A：?jiǎn)慰寺】贵w的優(yōu)點(diǎn)是特異性高。
Q:抗體的特異性有多重要
A:特異性高的抗體能夠有效的補貨目的蛋白質(zhì)同時(shí)降低背景。
Q:蛋白間的相互作用發(fā)生在哪里
A:蛋白質(zhì)的相互作用位點(diǎn)需要其他實(shí)驗來(lái)證明。
