Q：柱子上面的墊片實(shí)驗前是否要取出？

A：不用取出

Q:實(shí)驗目的為除去二抗中未結合的酶，NI-NTA His Bind Resin是否適用？

A：不推薦

Q：如何配置破菌緩沖液：

A：1 L 體積
     Tris    20 mM (6M HCl調pH值到7.4)    2.42 g
     NaCl    250 mM                       14.6 g
     PMSF    1 mM                         10 mL  100X 儲液
     100X PMSF 儲液(1.74 g PMSF 溶解于100 mL異丙醇), -20℃長(cháng)期保存，4℃保存數月，禁止室溫存放

Q：如何配置上樣緩沖液：

A：同破菌緩沖液，可以不加PMSF

Q：如何配置洗雜緩沖液：

A：在上樣緩沖液中添加咪唑至20 mM

Q：如何配置洗脫緩沖液：

A：在上樣緩沖液中添加咪唑至200 mM

Q：目的蛋白不同，緩沖液一樣的配方？

A：上述緩沖液為起始緩沖液，目的蛋白質(zhì)不同，可能需要不同的純化緩沖液。具體使用可以參考分子克隆等工具書(shū)或者文獻對緩沖液做修改。也可以根據蛋白質(zhì)性質(zhì)對上述緩沖液做修改

Q：凍融如何做，反復凍融幾次：

A：從-80°拿出來(lái)，再放進(jìn)去反復凍融至少3次

Q：目的蛋白質(zhì)在PH7.4下不穩定：

A：可以在pH7.3-8.3的范圍內對緩沖液的pH調整

Q：200 mM咪唑未洗脫下目的蛋白質(zhì)：

A：可以繼續提高咪唑濃度

Q：洗雜蛋白時(shí)目的蛋白質(zhì)也洗脫：

A：加5%甘油，0.1% tritonX100，0.5M NaCl可能會(huì )有效果，起到以下兩個(gè)作用：
（1）減少非特異吸附：甘油，去垢劑（triton），NaCl 都可以減少蛋白間疏水作用降低非特異吸附， 使雜蛋白更容易洗脫；
（2）通過(guò)減少蛋白間疏水作用使HIS-tag暴露的更加靈活，與Ni結合的更緊密，不容易被洗脫。

還有一種方法即洗雜緩沖液中咪唑濃度降低或者不添加

Q：如何再提高蛋白質(zhì)純化的效果：

A：一些情況下，緩沖液中添加5%-10%的甘油，0.1%的tween，0.5M的NaCl會(huì )提高蛋白質(zhì)純化的效果。

Q：破菌時(shí)可以用EDTA做蛋白酶抑制劑嗎

A：可以適當加入PMSF作為蛋白酶抑制劑，但是不能使用EDTA。

Q：破菌時(shí)可以用DTT做還原劑嗎

A：還原劑使用2 mM 2-ME，避免使用DTT，因為DTT會(huì )造成Ni/Co離子還原

Q：破菌緩沖液可以用PBS嗎

A：可以

Q：我購買(mǎi)的是1ml預裝柱，十倍柱體積平衡是指10ml上樣緩沖液平衡嗎

A：是

Q：一個(gè)過(guò)程下來(lái)需要多長(cháng)時(shí)間？正常流速每秒多少滴

A：重力柱，一般1s流速50ul左右
     機械柱可以?xún)x器調節，一般跟重力柱比可以快50-100%

Q：如果流速過(guò)慢，怎么處理

A：可以使用硅膠管控制上樣速度?；蝾A裝柱下面接軟管，再接蠕動(dòng)泵

Q：正常流速過(guò)一次柱就可以充分結合了嗎？是否需要多過(guò)幾次柱？

A：一次就可以，如果流速過(guò)快，可以再過(guò)一次

Q：上樣完成后，是否可直接進(jìn)入洗雜步驟

A：樣品上完以后，使用上樣緩沖液洗柱10個(gè)柱體積，注意將純化柱側壁上的殘留樣品洗干凈。

Q：如何洗去雜蛋白

A：使用10-20倍柱體積洗雜緩沖液將雜蛋白從純化柱上洗去，如果雜蛋白太多可以加大洗雜體積。

Q：如何判定洗雜步驟已經(jīng)完成

A： 一般10個(gè)柱體積即為洗雜步驟完成。

Q：雜帶多，雜蛋白洗不掉怎么辦

A：增加咪唑濃度，若仍無(wú)好轉，嘗試下：洗雜液中添加NaCl到150mM【Nacl濃度最高不要超過(guò)500mM】，TritonX100到1%【作用去掉柱料的一些非特異性吸附】，甘油到5%

Q：如何洗脫目的蛋白

A：洗雜結束以后，使用4-10倍柱體積洗脫緩沖液將目標蛋白洗脫。通常目標蛋白會(huì )在第二個(gè)柱體積中開(kāi)始流出。

Q：難以洗脫目的蛋白

A：難以洗脫的蛋白最高可用咪唑濃度500mM，或者EDTA連同鎳離子一起洗脫（不得已的辦法）。

Q：如何判斷收集的液體中有目的蛋白

A：收集液中的目的蛋白質(zhì)用SDS-PAGE檢測。

Q：純化完成后如何處理柱子/保存柱子

A：收集完成以后，使用8M尿素或者6M鹽酸胍5倍柱體積洗柱，再使用大量蒸餾水水洗柱，封閉純化管上下兩端保存在4 ℃，不要在-20 ℃凍結。如果長(cháng)期不用，加入5 ml 20%乙醇封閉保存。

Q：哪些情況下需要鎳柱重生

A：His?Bind Resin可以多次使用，不需要再生。如果需要使用一根柱子純化不同目標蛋白，或者長(cháng)時(shí)間使用造成金屬離子脫落，柱子堵塞、流速慢，可以按照下述方法進(jìn)行再生。

Q：如何重生

A：1. 用0.1 M EDTA洗柱4倍柱體積，將金屬離子洗脫下來(lái)，再用蒸餾水洗柱10倍柱體積除去EDTA殘留。
     2. 使用0.2 M醋酸洗柱4倍柱體積，10倍柱體積蒸餾水沖洗，再用0.1M 氫氧化鈉洗柱4倍柱體積， PBS/TBS平衡pH，大量蒸餾水洗柱。這一步需要避免強酸、強堿洗柱時(shí)間過(guò)長(cháng)。
     3. 用4%氯化鎳或者硫酸鎳3倍柱體積重新螯合10分鐘，也可以使用4%氯化鈷或者硫酸鈷螯合柱子。
     4. 柱子長(cháng)時(shí)間不用，加入20% 乙醇，封口后于4攝氏度保存，避免干裂或者凍結。

Q：可以重復用多少次

A：10-20次

Q：重生后效果如何？與初始狀態(tài)相比可以達到多少?

A：至少95%

Q：堵柱嚴重，怎么辦

A：如果柱子堵塞嚴重，重生時(shí)使用1% Triton X-100/PBS浸泡過(guò)夜。

Q：螯合鎳時(shí)間太長(cháng)，有時(shí)一天，是否會(huì )影響效果

A：沒(méi)有影響

Q：使用過(guò)程中發(fā)現堵塞嚴重，且流速越來(lái)越慢

A：樣品處理過(guò)程中，高速離心，最好用0.45um的濾膜過(guò)濾（推薦）
     如果柱子堵塞嚴重，重生時(shí)使用1% Triton X-100/PBS浸泡過(guò)夜。
     流速慢，可再柱子下面接一根軟管。

Q：如何保存

A：20%乙醇保存；4℃保存，1年有效。

Q：是否必須冰上操作？常溫是否可以？

A：在未知Ni-NTA His?Bind Resin融合蛋白穩定性的情況下，整個(gè)純化過(guò)程最好在4℃完成

Q：是否可以用EDTA

A：可以使用蛋白酶抑制劑防止降解，但是EDTA應當在純化完成以后再加入。

Q：是否可以使用非離子去垢劑改善結合？具體濃度？

A：可以，具體使用濃度參考以下：1% Triton X-100，1% Tween-20，0.03% SDS，0.1% NP-40。

Q：購買(mǎi)的1ml預裝柱可以結合多少蛋白

A：每根1 ml的His?Bind Resin親和柱一次可以結合大約20 -30 mg His-tag融合蛋白

Q：我們的樣品種類(lèi)較多，可以用同一根柱子嗎

A：最好不同的融合蛋白使用不同的柱子，樣品較多，可以使用多根柱子，或者純化完一種樣本后需重生后再純化另外一種蛋白。

Q：有哪些方法可以減少雜蛋白的結合

A：上樣緩沖液中可以含有1 mM咪唑減少雜蛋白的結合

Q：我的目的蛋白在咪唑20mM時(shí)就掉下來(lái)了

A：部分目標蛋白會(huì )在20 mM咪唑洗雜緩沖液中流出，所以對于新樣品，每一步都要留樣電泳，摸索純化條件。

Q：我的目的蛋白是包涵體形式，如何變性

A：如果融合蛋白是包涵體形式，那么可以選擇變性純化方法，通常是在緩沖液中加入8M 尿素以及去垢劑。變性純化時(shí)一定要做好樣品處理，不然容易造成柱子堵塞。

Q：變性后的蛋白如何處理

A：變性方法得到的蛋白一般沒(méi)有活力，可以用來(lái)制備抗體，但如想測定活力，就需要做復性。

Q：變性蛋白如何復性

A：蛋白質(zhì)復性方法有很多種，稀釋法、透析法、離子交換復性法，分子篩復性法，自己選擇合適的方法來(lái)做。

Q：除了可以咪唑洗脫，還有其他方法可以洗脫嗎

A：除了常規的咪唑洗脫方法以外，還有EDTA洗脫和pH梯度洗脫。后兩種方法缺點(diǎn)明顯，只在特殊情況下使用。

Q：去除his 標簽的方法

A：可以使用在柱酶切的方法得到去除His-tag的目標蛋白。經(jīng)常使用的酶包括：Thrombin；Enterokinase；TEV protease等。我們推薦TEV protease（貨號：RPP002），因為這種酶的特異性較好，是帶有Ni-NTA His?Bind Resin的重組酶，方便除去。在柱酶切可以提高產(chǎn)物純度，但是空間位阻可能造成酶切效果不好，按照慣例，多數實(shí)驗不用切除Ni-NTA His?Bind Resin。

Q：金屬離子脫落，柱子失去顏色或者變色

A：確證破菌緩沖液中不含有EDTA、EGTA、檸檬酸、DTT等螯合劑；重新處理柱子，為His-Binding-resin螯合金屬離子。

Q：融合蛋白是包涵體

A：降低表達溫度（16-22℃），降低IPTG誘導濃度（10-100 μM），縮短誘導時(shí)間（2-5小時(shí)）；做包涵體復性，或者使用變性純化。

Q：表達量太低

A：換載體或者優(yōu)化密碼子序列。

Q：融合蛋白不結合

A：測序檢查核酸序列，將tag從一端移到另一端，增加接頭序列。

Q：純化的蛋白沒(méi)有活性

A：調整破菌條件，超聲產(chǎn)生的熱量可能使GST蛋白變性。

Q：融合蛋白被蛋白酶降解

A：在破菌緩沖液中加入蛋白酶抑制劑，縮短純化時(shí)間，降低溫度。

Q：融合蛋白不能從柱子上洗脫

A：加入0.1% TritonX-100；增加NaCl濃度；使用變性純化。

Q：融合蛋白被蛋白酶降解

A：在破菌緩沖液中加入蛋白酶抑制劑，縮短純化時(shí)間，降低溫度。

Q：有些宿主細胞的分子伴侶蛋白會(huì )與融合蛋白結合

A：上樣前加入5 mM DTT，或者使用10 mM MgSO4 50 mM Tris，2 mM ATP先反應20分鐘，讓伴侶蛋白去結合。

Q：超聲裂菌過(guò)度，目標蛋白被打斷

A：注意超聲儀的工作功率以及超聲時(shí)間，使用顯微鏡控制裂菌。

Q：金屬離子親和柱非常容易產(chǎn)生非特異性吸附，特別是在目標蛋白表達量較低時(shí)

A：在上樣緩沖液中加入去垢劑，可以有多種選擇；加大目標蛋白上樣量；減少bead使用量；加大鹽離子濃度；咪唑梯度洗脫；變性純化等等。

Q：PMSF是否可以不加

A：PMSF為蛋白酶抑制劑，作用是防止目的蛋白被降解，可以不加

Q：破菌液中加咪唑嗎

A：可以不加，如一定要加，建議可以加1-5mM，加了會(huì )競爭結合，減少雜蛋白的結合，增加雜蛋白的穿出

Q：重復使用，效率不高，怎么辦

A：在第一次使用后，處理一下“8mol 尿素 沖洗（1ml鎳柱對應20ml尿素），用水沖洗干凈尿素，上0.1mol 硫酸鎳 （1ml鎳柱對應1ml硫酸鎳）”，然后再進(jìn)行后面的操作

Q：柱子上面的墊片實(shí)驗時(shí)是否需要取出，墊片是什么作用

A：不要取出，墊片的作用：1、擋住臟東西；2、防止膠飄起來(lái)

Q：結合不到蛋白或結合力弱

A：1. Binding buffer(或者細胞裂解buffer)
        咪唑濃度不要超過(guò)5mM，NTA和HIS-Tag的結合力較弱所以最好不加咪唑，先把蛋白binding上去再洗雜蛋白；
        PH中性或偏堿（PH 7.0-8.5）酸性條件下蛋白很難和鎳柱結合；
        buffer中不要有EDTA(可以螯合鎳)，DTT等還原劑（可以還原鎳）。
    2. 蛋白特性
        蛋白折疊后his-tag被包裹在內部，無(wú)法暴露出來(lái)與鎳柱結合； 可以嘗試在蛋白中加入變性劑尿素（2M-8M）在部分或完全變性 的條件下純化蛋白。

Q：不掛柱

A：不掛柱的情況比較常見(jiàn)，一般是蛋白的問(wèn)題，與填料本身沒(méi)有關(guān)系，建議重新構建克隆試下

Q：來(lái)源于哪些表達系統的His蛋白有很好的純化效果（原核？真核？例如桿狀病毒/哺乳細胞/酵母/細菌等）

A：只要目的蛋白質(zhì)帶His標簽都可以用鎳柱純化，注意分泌表達的蛋白質(zhì)，如果培養基中含有復雜的成分，其中可能含有還原劑或螯合劑，此時(shí)培養基上清不能直接用鎳柱純化，應當先將培養基脫鹽處理再上柱純化。

Q：蛋白量少，推薦用多大規格的預裝柱

A：正常20mg/ml的載量，推薦小規格預裝柱

Q：上清渾濁，是用IDA好還是NTA好

A：上清渾濁，推薦適當稀釋上清，并在此離心或者過(guò)0.45um濾膜處理。IDA或NTA都可純化。

Q：如何自己裝柱（重力柱）

A：參考裝柱說(shuō)明，詳詢(xún)請咨詢(xún)技術(shù)人員

Q：蛋白大小27KD，是否可用我們的鎳柱

A：可以

Q：預裝柱純化過(guò)程中，流速越來(lái)越慢，除了加硅膠管，還有什么方法

A：推薦再生柱料。

Q：我在純化時(shí)變性緩沖液里加入巰基乙醇，對鎳柱是否有影響？如果不用巰基乙醇會(huì )有什么影響？

A：不加是沒(méi)有影響的，不過(guò)有些蛋白可能會(huì )出現沉淀的情況，這個(gè)要看蛋白特性來(lái)看的。巰基乙醇濃度不要超過(guò)10mM，或者5mM DTT

Q：如果表達蛋白中含有半胱氨酸沒(méi)有二硫鍵，在純化時(shí)是否需要加還原劑保護，一般用多大濃度

A：可以不加還原劑，不加還原劑可能會(huì )有20%-30%二硫鍵。如果要全部游離狀態(tài)的話(huà)，可以加1mM DTT

Q：純化率達到多少？

A：大部分蛋白可達到95%以上，特殊蛋白情況不定，尤其是包涵體蛋白，可能達不到95%

Q：生物酶是否可以用鎳柱純化

A：可以

Q：洗雜蛋白時(shí)，咪唑加到40mM，目的蛋白就會(huì )掉下來(lái)，20-30mM雜蛋白又總洗不掉，反復做了幾次，始終收不到想要的蛋白，請問(wèn)有什么建議嗎？

A：20mM洗雜蛋白，洗雜緩沖液中添加NaCl 0.5M，甘油10%，triton X-100 0.5%。 50mM洗脫目的蛋白質(zhì)。

Q：1ml可以加多少蛋白液（菌液）？

A：1mL預裝柱載量可以達到10mg，根據表達的蛋白質(zhì)的量來(lái)決定上樣體積。

Q：融合蛋白鎳柱純化有雜帶，目標蛋白量不算小，但雜帶很明顯。排除目的蛋白被降解的可能。

A：緩沖液中NaCl 0.5M，甘油10%，triton X-100 0.5%。 來(lái)降低非特異性結合。

Q：柱子中有大氣泡，且排不出去。

A：手工重力柱 裝柱時(shí) 有時(shí)里面會(huì )有小氣泡 對于流速和純化都不會(huì )有影響的
     如果影響到了流速和純化效果的話(huà)，可以加3/4柱體積的 20%乙醇 然后用1ml槍頭將上面的篩片撥動(dòng) 重新裝一下上面的篩片即可

Q：包涵體蛋白，尿素變性后怎么做

A：1.  破菌離心收集包涵體沉淀。
     2. 包涵體沉淀用含1%的Triton-100，超聲重懸。再離心收集沉淀。
     3. 選作，步驟2再重復一遍。
     4. 包涵體沉淀用6M （如果6M不溶，補加尿素到8M）重溶，短暫超聲可以輔助包涵體溶解。
     5. 離心，去掉不溶的沉淀。
     6. 配置復性緩沖液：含5mM GSH，0.5mM GSSG，10%甘油的PBS或者TBS
     7. 復性緩沖液預冷到0-4℃，電磁攪拌旋轉下，將6M尿素中的變性蛋白，慢慢滴加到復性緩沖液中。按照1體積的變性蛋白質(zhì)，20-100體積的復性緩沖液的體積比稀釋。
     8. 繼續攪拌1小時(shí)。
     9. 選作，4℃靜置過(guò)夜。
     10. 選作，離心去除未變性的蛋白質(zhì)。如果純重力上樣，推薦做此步，防止柱子堵塞不流。
     11. 復性蛋白質(zhì)上NTA-鎳柱純化。
  若做的是包涵體蛋白，推薦用NTA-鎳柱（變性液可以直接過(guò)柱），不可用IDA-鎳柱，復性后蛋白會(huì )破壞IDA鎳柱

Q：要用鎳柱做實(shí)驗，樣品大于55kd，為包涵體，原核表達的？

A：可以用6M鹽酸胍變性，然后用帶8M尿素的緩沖液（鎳柱純化全程）
     樣品用6M脲變性溶解后，緩沖液也是相同條件，然后用咪唑梯度洗脫即可。
     8M脲有點(diǎn)高了，而且不好溶解；6M胍溶液太稠了，溶液流的太慢了（如果用機器，壓力就會(huì )太大）。

Q：1.原核表達蛋白時(shí)如何增加目的蛋白表達量？乳糖取代IPTG效果是否明顯？2.若目的蛋白為包涵體，如何增加最后復性得率？是先復性？還是先純化？3.目的蛋白易降解，在表達、純化和儲存方面需要注意事項

A：1. 原核表達蛋白質(zhì)增加蛋白量需要摸索條件，乳糖替代IPTG誘導有時(shí)候表達量增加有時(shí)候減少。一般規律是如果不容易降解的重組蛋白質(zhì)增加誘導時(shí)間會(huì )增加表達量，容易降解不穩定的蛋白質(zhì)需要摸索一個(gè)誘導時(shí)間，誘導時(shí)間過(guò)長(cháng)會(huì )造成蛋白質(zhì)降解，表達量降低。
    2. 包涵體復性液需要摸索不同的復性方法和復性緩沖液。一般推薦先復性再純化。
    3. 目的蛋白質(zhì)容易降解，一般需要降低表達時(shí)候的溫度，摸索一個(gè)合適的誘導時(shí)間，純化時(shí)在低溫條件下進(jìn)行，純化時(shí)間要快，盡量誘導結束，盡快收菌、破菌、上柱純化。純化后的蛋白質(zhì)保存嘗試DTT、甘油等保護劑，在-80℃保存。

Q：上樣后剛開(kāi)始慢慢滴，沒(méi)一會(huì )就不滴了，是否可以用洗耳球加壓，控制1s一滴，會(huì )不會(huì )太快。

A：這個(gè)情況是正常的，可以用洗耳球，但是這樣做工作量太大，太累了。建議：
   1. 12000rpm 離心10min，如果還是比較渾濁，再離心一次。
   2 或者0.45um濾膜過(guò)濾一下。

Q：蛋白裂解液粘稠該如何處理

A：裂解液粘稠是流不下來(lái)的，建議①在超聲儀上做超聲，打斷核酸，裂解液會(huì )變清亮不粘稠,若是包涵體蛋白，達不到清亮但不會(huì )粘稠②反復凍融，有好轉，效果沒(méi)做超聲好③加入benzonase

Q：第一遍過(guò)柱速度慢，不接軟管的情況下可以如何調整加快流速。

A：樣品稀釋?zhuān)档驼吵矶取?

Q：最后一步用8M尿素或鹽酸胍洗柱是否一定要做，加尿素的作用是什么？

A：不是必須步驟，但若不洗，后續純化會(huì )有雜蛋白。加尿素可以使蛋白變性，非特異性結合的蛋白洗下來(lái)。

Q：如何洗去咪唑

A：用水大量沖洗

Q：顏色很淡，會(huì )不會(huì )影響效果？需要重新螯合Ni嗎

A：不影響效果，不用重新螯合。

Q：鎳柱顆粒大小是多少

A：65-160um

Q：未能純化到His標簽蛋白？

A：建議先確認是否為蛋白沒(méi)有掛柱直接流穿？還是蛋白未被洗脫下來(lái)？若排除這兩點(diǎn)，我們還總結了以下因素，建議您一一排除：

  1、Q：超聲功率不對

        A：超聲前加入溶菌酶，改變超聲功率

  2、Q：樣品或者結合緩沖液不對

        A：檢測PH及樣品盒結合緩沖液的組成份。保證溶液中的螯合劑或強還原劑濃度及咪唑的濃度不高。

  3、Q：組氨酸的標簽沒(méi)有完全的

        A：在變性條件下（用4-8M脲，或4-6M鹽酸胍）進(jìn)行純化

  4、Q：His標簽丟失

       A：建議1、檢查His是否表達，上游構建，改變His標簽的位置（C-terminal or N-terminal)，必要時(shí)增加His個(gè)數（常用6-10個(gè)）
            建議2、降低流速、增加孵育時(shí)間

            建議3、尋找最佳的結合金屬離子
            Ni2+通常是宿主細胞蛋白中純化大多數6個(gè)組氨酸標記重組蛋白的一般常用金屬離子。蛋白和金屬離子之間的結合強度受長(cháng)度、位置、親和標記在蛋白的暴露程度、所用離子的類(lèi)型、以及緩沖液的PH這幾種因素影響，因此一些蛋白用其他離子可能更容易地進(jìn)行純化而不同Ni2+。

Q：目的蛋白洗脫不下來(lái)

  1、Q：洗脫條件太溫和（組氨酸標記的蛋白質(zhì)仍然結合在柱上，結合力較強）

        A：增加咪唑的梯度或降低PH來(lái)找出最佳的洗脫條件。

  2、Q：若您選用降低PH的方法洗脫的，PH低于3.5，會(huì )導致鎳離子脫落

        A：改變洗脫方法，咪唑競爭性洗脫

  3、Q：蛋白已沉淀在柱上

        A：減少上樣量，或使用咪唑的線(xiàn)性梯度而不是分步洗脫以降低蛋白的濃度。試用去污劑或改變NaCL的濃度，或在變性條件（去折疊）下洗脫（用4-8M脲，或4-6M鹽酸胍）。

  4、Q：非特異性疏水或其他相互反應

        A：洗脫緩沖液中添加非離子去污劑（如2%Triton X-100）或增加NaCL的濃度。

Q：洗脫后雜帶較多，什么原因？如何優(yōu)化？很多天然的蛋白也會(huì )帶有HIS，所以經(jīng)常會(huì )出現HIS標簽蛋白洗脫后有一些雜帶

  1、Q：蛋白酶部分降解了標簽蛋白

        A：請添加蛋白酶抑制劑。（慎用EDTA）

  2、Q：雜質(zhì)對鎳離子有更高的親和性

        A：推薦1：優(yōu)化咪唑濃度，以確保宿主細胞蛋白質(zhì)的低結合和組氨酸標記的目標蛋白質(zhì)的強結合之間的最佳平衡。分步或線(xiàn)性洗脫摸出最優(yōu)的咪唑結合和清洗濃度；在樣品中加入與結合緩沖液同樣濃度的咪唑；咪唑的梯度不大（20個(gè)或更多的柱床體積），可能分離出有相似結合強度的蛋白。
            推薦2：篩選最適合的緩沖液條件，NaCL濃度，PH的范圍都需要進(jìn)行篩選。

Q：雜質(zhì)和標簽蛋白結合

A：在超聲前加入還原劑或去垢劑；增加去垢劑的濃度，（2%Triton X-100 or2% Tween 20)；或者在washing buffer中增加甘油的濃度（50%）減少非特異性的相互反應?？紤]增加咪唑的濃度或者改變金屬離子。

Q：洗滌不充分

A：增加洗滌的次數。

Q：蛋白過(guò)鎳柱純化的原理

A：鎳可以與有His標簽的堿性蛋白結合。蛋白上樣后，帶有his標簽的蛋白特異性結合到柱子里，雜蛋白流出。鎳也可以與咪唑結合，咪唑競爭性結合到鎳上，再用咪唑梯度洗脫，目的蛋白就被洗下來(lái)了，收集穿出液，里面就是目的蛋白，再透析掉咪唑。

Q：是否需要孵育?還是直接過(guò)柱流下來(lái)，直接結合了？

A：直接過(guò)柱流下來(lái)，鎳柱與蛋白結合很快，不需要孵育

Q:推薦的線(xiàn)性流速是多少？

A:fast flow正?？梢?cm/min，一般推薦0.5cm/min就已足夠（1ml/min）。

Q:柱子不小心干了，怎么處理？填料出現了結塊

A：可以用20%乙醇或PBS/TBS重懸一下即可。出現結塊用1ml槍吹散。

Q:蛋白表達量較低，洗完之后如何濃縮

A：超濾管濃縮

Q：CHO細胞表達的蛋白，能否用鎳柱純化

A：只要帶his標簽就可以用鎳柱純化。但是蛋白質(zhì)樣品要預處理一下，引物cho細胞培養基上清組分比較復雜，可能影響掛柱。

Q：蛋白樣品如何預處理

A：各種預處理方法，比如超濾去除培養基中大部分氨基酸，硫酸銨沉淀，或者透析，這個(gè)是蛋白純化策略問(wèn)題，不同的樣本量，樣本形式都不一樣。