Q:GST-Resin 應用于哪些實(shí)驗

A:實(shí)驗室級別小量純化GST融合蛋白
   純化包含谷胱甘肽結合序列的非變性蛋白質(zhì)，如谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶等
   GST Pull-down實(shí)驗

Q:GST融合蛋白的表達

A:離心收集250 ml表達目標蛋白的大腸桿菌，凍融或超聲破菌于10-15 ml破菌緩沖液中，離心取上清。

Q:破菌緩沖液配方

A:20-50 mM Tris-HCl，pH 7.5-8.5，含0.25 M NaCl

Q:洗脫緩沖液配方

A:破菌緩沖液中補加新配制還原型谷胱甘肽（GSH）到終濃度為6 mM，10 mg GSH干粉可配制5 ml洗脫緩沖液

Q:其他常用緩沖液配方

A:其它常用緩沖液為PBS

Q:GST融合蛋白表達時(shí)，是否加入EDTA、PMSF

A:這一步可以適當加入EDTA、PMSF等蛋白酶抑制劑

Q:流速過(guò)慢，如何處理

A:流速過(guò)慢，可以使用硅膠管控制上樣速度。

Q:上樣前如何平衡柱子

A:上樣緩沖液沖洗10個(gè)柱體積即為平衡柱子

Q:上樣后直接洗脫

A:樣品上樣完成以后，使用破菌緩沖液洗柱10-20個(gè)柱體積，注意將純化柱側壁上的殘留樣品沖洗干凈。

Q:如何洗脫

A:使用2-6ml洗脫緩沖液將樣品從GST-Resin純化柱上洗脫

Q:樣品量較多，如何洗脫

A:如果樣品量較多，可以使用大體積純化柱，洗脫液的體積適當增加

Q:正常流速是什么樣

A:正常流速大約2秒一滴到1秒一滴之間。

Q:純化結束后，如何保存

A:純化結束以后，使用大量純水洗柱，封閉上下兩端以后保存在4 ℃，避免讓柱子干裂或者凍結。

Q:同一根柱子是否可以純化不同蛋白

A:純化不同的融合蛋白請使用不同的柱子，如果需要再次用于純化其它蛋白，建議使用8M尿素或者6M鹽酸胍處理樹(shù)脂。

Q:洗脫后，如何處理樣品

A:樣品洗脫以后，需要及時(shí)使用蛋白超濾管濃縮以及切換緩沖液，并選擇適當條件保存目標蛋白。

Q:實(shí)驗是否可以在常溫下進(jìn)行

A:在未知GST融合蛋白穩定性的情況下，整個(gè)純化過(guò)程需要在4℃完成

Q:是否可以加蛋白酶抑制劑

A:可以使用蛋白酶抑制劑防止降解

Q:如何改善結合

A:可以在緩沖液中補加非離子去垢劑等改善結合，具體使用濃度參考以下：1% Triton X-100，1% Tween-20，1% CTAB，10 mM DTT，0.03% SDS，0.1% NP-40。

Q:如果gst蛋白為包涵體，是否可以直接純化

A:如果GST融合蛋白是包涵體形式，那么只有做了復性以后，才可以使用GST-resin純化，通常的復性過(guò)程耗時(shí)、耗力，并不容易成功。
   1、降低表達溫度（16-22℃），降低IPTG誘導濃度（10-100 μM），縮短誘導時(shí)間（2-5小時(shí)）。
   2、做包涵體復性，或者換一種表達載體。

Q:如果是包涵體蛋白，怎么變性（用什么溶液），變性后怎么辦

A:變性蛋白不能直接過(guò)GST柱子，必須復性后才能過(guò)柱。變性用8M尿素或6M鹽酸胍，變性后的復性步驟如下：
   1.  破菌離心收集包涵體沉淀。
   2. 包涵體沉淀用含1%的Triton-100，超聲重懸。再離心收集沉淀。
   3. 選作，步驟2再重復一遍。
   4. 包涵體沉淀用6M （如果6M不溶，補加尿素到8M）重溶，短暫超聲可以輔助包涵體溶解。
   5. 離心，去掉不溶的沉淀。
   6. 配置復性緩沖液：含1-5mM DTT，10%甘油的PBS或者TBS。（不用還原型谷胱甘肽是因為它影響GST柱料）
   7. 復性緩沖液預冷到0-4℃，電磁攪拌旋轉下，將6M尿素中的變性蛋白，慢慢滴加到復性緩沖液中。按照1體積的變性蛋白質(zhì)，20-100體積的復性緩沖液的體積比稀釋。
   8. 繼續攪拌1小時(shí)。
   9. 選作，4℃靜置過(guò)夜。
   10. 選作，離心去除未變性的蛋白質(zhì)。如果純重力上樣，推薦做此步，防止柱子堵塞不流。
   11. 復性蛋白質(zhì)上GST柱純化。

Q:如何去除GST標簽

A:可以使用在柱酶切的方法，得到去除GST的目標蛋白。我們推薦TEV protease和PPase，因為這兩種酶的特異性較好，都是帶有Tag的重組酶，方便除去。其中PPase是和PGEX-6p-1載體配套的酶，效果很不錯。

Q:一個(gè)過(guò)程需要多長(cháng)時(shí)間

A:根據樣本量時(shí)間在半個(gè)小時(shí)到2小時(shí)之間

Q:GST如何重生

A:0.1M NaOH 洗10個(gè)柱體積，然后立即平衡到平衡緩沖液中，20%乙醇保存。

Q:如何保存

A:20%乙醇保存柱料

Q:洗脫緩沖液中的GSH濃度是否有要求

A:洗脫緩沖液中的GSH濃度不要太高，否則會(huì )改變洗脫緩沖液的pH，通常使用4-10 mM，注意高濃度GSH具有較強酸性，可能讓蛋白失活沉淀。

Q:如果洗脫緩沖液中的GSH濃度過(guò)高了，如何處理

A:洗脫的緩沖液中含有高濃度的GSH，可能影響后續的實(shí)驗。請使用超濾管或者脫鹽柱進(jìn)行除去。

Q:融合蛋白不能結合GST-resin

A:增加目標蛋白和GST-resin結合的時(shí)間，多次過(guò)柱。有時(shí)候需要調整上樣緩沖液的pH, 6-9之間。
也可以嘗試加入非離子去垢劑。

Q:融合蛋白GST沒(méi)有活性

A:調整破菌條件，超聲產(chǎn)生的熱量可能使GST蛋白變性。

Q:融合蛋白被蛋白酶降解

A:在破菌緩沖液中加入蛋白酶抑制劑，縮短純化時(shí)間，降低溫度。

Q:融合蛋白不能從柱子上洗脫

A:把洗脫GSH濃度提高到15 mM, 同時(shí)調整洗脫緩沖液pH到8.0-9.0；加入0.1% TritonX-100；增加NaCl濃度。

Q:洗脫的目標蛋白有大量雜帶，雖然GST蛋白本身的穩定性很好，但融合蛋白有可能在表達過(guò)程中就發(fā)生降解

A:可以使用抗體檢測具體在純化的哪一步發(fā)生降解。通常在破菌緩沖液中加入蛋白酶抑制劑、縮短純化時(shí)間、降低培養溫度會(huì )有幫助。

Q:有些宿主細胞的分子伴侶蛋白會(huì )與融合蛋白結合

A:上樣前加入5 mM DTT，或者使用10 mM MgSO4 50 mM Tris，2 mM ATP先反應20分鐘，讓伴侶蛋白去結合。

Q:超聲裂菌過(guò)度，目標蛋白被打斷

A:注意超聲儀的工作功率以及超聲時(shí)間，使用顯微鏡控制裂菌。

Q:GST-resin可能有非特異性吸附

A:在上樣緩沖液中加入去垢劑，可以有多種選擇：1% TritonX-100、1% Tween-20、0.03% SDS或者0.1% NP-40。

Q:GST-resin作用

A:純化具有GSH結合活性的谷胱甘肽轉移酶（GST）以及其融合蛋白

Q:結合力

A:膠粒平均直徑60微米，比表面積大，結合大腸桿菌重組GST蛋白的能力大于8 mg/ml

Q:適用實(shí)驗

A:可以滿(mǎn)足大多數實(shí)驗室級別小量純化GST融合蛋白以及GST Pull-down實(shí)驗所需。

Q:產(chǎn)品優(yōu)勢

A:◆性質(zhì)穩定：用Sepharose為載體，共價(jià)偶聯(lián)高純度的谷胱甘肽，高特異性吸附；
   ◆重復性好：同樣實(shí)驗條件下，保障實(shí)驗結果的可重復性；
   ◆結合能力強：膠粒平均直徑60微米，比表面積大，結合大腸桿菌重組GST蛋白的能力大于8 mg/ml，每根1ml的GST-resin親和柱一次可以結合大約10 mg GST融合蛋白?？梢詽M(mǎn)足大多數實(shí)驗室級別小量純化GST融合蛋白以及GST Pull-down實(shí)驗所需；
   ◆使用簡(jiǎn)單方便；
   ◆ 快速、溫和
   ◆ 尤其適合在大腸桿菌、昆蟲(chóng)細胞和哺乳動(dòng)物細胞中表達的GST標簽蛋白。

Q:除適用于大腸桿菌表達的gst蛋白，昆蟲(chóng)細胞、哺乳細胞是否均可用

A:只要蛋白質(zhì)帶gst標簽就可用gst resine純化

Q:重復性怎么樣

A:重復性非常好，純度也非常高