Q:ECL反應原理

A:蛋白質(zhì)或核酸電泳分離后轉印到膜上，以一抗及HRP標記的二抗結合膜上的目的蛋白，或以HRP標記的探針直接或間接結合膜上的核酸。洗膜后用本產(chǎn)品配置的ECL工作液，在室溫下孵育膜1分鐘，將印跡膜用保鮮膜包被粘貼固定于X光片曝光暗盒中，然后暗室中將X光膠片壓在膜上曝光數秒到數分鐘。顯影定影后蛋白質(zhì)或核酸條帶可清晰顯示在X光膠片上。也可不進(jìn)行X光膠片曝光，而直接對印跡膜進(jìn)行熒光CCD掃描。光信號支持重復曝光，以獲得最佳的結果。也可洗膜脫抗體后可供再次檢測。

Q:封閉

A:按常規方法完成SDS-PAGE和電轉膜操作，將轉印好的膜從轉膜裝置上卸下來(lái)，并用封閉劑封閉膜上的非特異結合位點(diǎn)，室溫下?lián)u晃封閉1小時(shí)或2-8℃靜置封閉過(guò)夜?！痉忾]非常重要】

Q:加一抗后孵育多久

A:棄封閉液，加入一抗工作液，室溫下?lián)u晃孵育1小時(shí)或2-8℃靜置孵育過(guò)夜。

Q:緩沖液沖洗

A:用洗膜緩沖液漂洗膜2次，然后用充分體積的洗膜緩沖液洗膜4-6次，每次5分鐘。

Q:二抗孵育多久

A:用標記HRP的二抗工作液室溫下?lián)u晃孵育1小時(shí)

Q:未結合二抗

A:用洗膜緩沖液漂洗膜2次，然后用充分體積的洗膜緩沖液洗膜4-6次，每次5分鐘，徹底洗掉沒(méi)有結合的二抗

Q:如何加ECL

A:將試劑A和試劑B按1:1的比例混合成ECL工作液，根據每平方厘米膜片使用0.1-0.2ml的量以覆蓋全膜片。用ECL工作液充分覆蓋膜后室溫孵育1分鐘。

Q:ECL工作液配置后如何保存，保存多久

A:ECL工作液最好在臨時(shí)用前現配現用，室溫下放置最多不超過(guò)1小時(shí)。

Q:曝光時(shí)間

A:第一次曝光60秒，之后根據結果調整曝光時(shí)間，以達到最佳效果。

Q:信號太強

A:如果信號太強，減少曝光時(shí)間或脫掉抗體后降低抗體濃度重新孵育。

Q:發(fā)光何時(shí)最強

A:在孵育后的最初5-30分鐘內發(fā)光最強，發(fā)光最長(cháng)可持續數小時(shí)，但隨著(zhù)時(shí)間的推移光信號減弱。

Q:膜的重復使用

A:配置62.5mm Tris-HCL，ph6.7,2%SDS，7ml/100ml的巰基乙醇的溶液，膜放入后，70℃振蕩水浴30分鐘。再用TBST或PBST緩沖液洗脫，最后用BSA（牛血清白蛋白）或牛奶封閉。

Q:封閉劑的選擇

A:根據不同的實(shí)驗選擇合適的封閉劑，如避免使用脫脂奶粉去檢測抗生素/生物素系統，因為牛奶中含有許多內源生物素，會(huì )導致背景過(guò)高。

Q:洗滌緩沖液和封閉液使用過(guò)多會(huì )不會(huì )沒(méi)有發(fā)光信號

A:不會(huì )

Q:緩沖液中含有疊氮鈉

A:避免使用含有疊氮鈉的緩沖液，疊氮鈉會(huì )抑制HRP反應，干擾實(shí)驗結果。

Q:蛋白豐度不同，曝光時(shí)間有差異嗎

A:可能是數秒至數小時(shí)。

Q:曝光時(shí)間過(guò)長(cháng)

A:時(shí)間過(guò)長(cháng)會(huì )使背景加深

Q:曝光時(shí)間太短

A:曝光不足會(huì )導致條帶模糊。

Q:曝光條帶不佳

A:如果曝光條帶不佳，可用洗膜緩沖液洗膜，重新孵育二抗，然后重新用ECL發(fā)光和曝光。

Q:ECL用什么膠片檢測比較好

A:柯達醫用膠片  XBT-1.

Q:在做免疫印跡實(shí)驗中，膜與保鮮膜之間的氣泡沒(méi)有處理好，會(huì )導致什么后果？有沒(méi)有影響？

A:會(huì )導致實(shí)驗中蛋白條帶為點(diǎn)狀，影響圖片效果，造成干擾

Q:發(fā)光時(shí)間持續多久

A:發(fā)光時(shí)間可以持續15min

Q:亮度不夠，有點(diǎn)不清楚，信號弱或無(wú)信號，可能原因？解決方法？

A:待檢測蛋白質(zhì)表達量太低，一抗稀釋倍數太低或者特異性不好，二抗稀釋倍數太低。

Q:如果檢測的是同一個(gè)蛋白，洗脫步驟可以簡(jiǎn)化嗎？

A:如果是檢測同一個(gè)蛋白重復發(fā)光，那只要用TBST或PBST洗脫就行
   我們推薦的步驟針對：如果需要同時(shí)檢測另外一種蛋白時(shí)，就需要先洗膜，推薦的配方其實(shí)就是洗膜液，也可以找現成的洗膜液

Q:出現非特異性條帶，可能原因，解決方法？

A:非特異性條帶，通常原始是抗體特異性不好，尤其使用多抗的時(shí)候會(huì )出現這種問(wèn)題。優(yōu)化一下抗體使用的稀釋倍數，能夠解決或者部分緩解這種情況。

Q:靈敏度可以，但是背景值高，是否可以稀釋使用？

A:背景值高一般解決情況是提高抗體的稀釋倍數。一般不推薦ECL稀釋使用。

Q:ECL是否可替換DAB顯色液？

A:ECL不可替換DAB顯色液，二者用處各不相同。

Q:靈敏度太高了，一秒后就變黑

A:減少抗體的量 如果抗體本身濃度太高的話(huà)，也可以對ECL反應液進(jìn)行稀釋