Q:保真性
A:保真性能比普通Taq聚合酶高80倍
Q:延伸速率
A:在推薦的條件下大于每分鐘2kb
Q:活性定義
A:嗜熱菌DNA Polymerase的活性單位定義為:在推薦的緩沖反應體系中,以大馬哈魚(yú)精DNA為模板,68° 30分鐘內合成10nmol核酸所需要的酶量為1活性單位
Q:質(zhì)量控制
A:經(jīng)酶切實(shí)驗檢測無(wú)外源核酸酶污染,PCR方法未檢測到宿主DNA殘留,-20°存放一年,無(wú)明顯活性喪失。
Q:貯存溶液
A:50mM Tris-HCL(PH 7.6),50mM KCL,1mM DTT,0.1mM EDTA,50%(v/v) glycerol
Q:dNTP注意事項
A:對于高保真酶,dNTP中雜質(zhì)強烈抑制聚合酶反應,請使用高質(zhì)量的dNTP
Q:引物長(cháng)度
A:引物的適當長(cháng)度為20-35bp;過(guò)長(cháng)或者過(guò)短,需要優(yōu)化退火溫度;
Q:GC含量高
A:GC含量高的情況下,請使用GC buffer,對保真性沒(méi)有影響;擴增基因組或GC含量較高時(shí),建議98°變性
Q:可參考PCR體系
A:
KOD | 0.5-1ul |
2xKOD buffer | 10ul |
dNTP(10mM each) | 0.5ul |
Primers(10uM) | 1ul(各0.5ul) |
無(wú)菌H2O | Up to 20ul |
Q:可參考PCR程序(根據實(shí)際反應條件摸索優(yōu)化)
A:
95℃或98℃ 4min | 1Cycle |
95℃或98℃ 20s |
普通質(zhì)粒擴增(28 Cycles) 質(zhì)粒點(diǎn)突變(20 Cycles) cDNA模板擴增(28-35 Cycles) 末端補平(5 Cycles) |
52°(Tm-5℃) 20s | |
68℃ 1.5kb/min | |
68℃ 3min | (1 Cycle) |
Q:組分中是否含有Mg2+
A:buffer中含mg離子
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