Q:cck-8是否可檢測懸浮細胞

A:可以

Q：96孔板每孔孵育多少個(gè)細胞

A：通常細胞增殖實(shí)驗每孔約2000個(gè)細胞，細胞毒性實(shí)驗每孔約5000個(gè)細胞，具體每孔所用的細胞的數目，需根據細胞的大小，細胞增殖速度的快慢等因素決定。

Q：說(shuō)明書(shū)推薦每孔2000個(gè)細胞，若我的是每孔10000個(gè)細胞，每孔加多少CCK8？

A：培養基和CCK-8比例10:1就可以

Q：96孔板，每孔中接種多少細胞懸液

A：100 ul /孔

Q：48孔板或24孔板是否可用

A：建議不用，48孔和24孔均不可上酶標儀檢測。推薦常規96孔板

Q：96孔板每孔加入多少CCK-8溶液

A：每孔加入10ul 7Sea-CCK-8，如果起始的培養體積為200ul，則需加入20ul  7Sea-CCK-8，培養基和CCK-8比例10:1

Q：如何做空白對照

A：可以用加相應量細胞培養基和7Sea-CCK-8但不加細胞的孔作為空白對照，若擔心所使用的藥物會(huì )干擾檢測，需設置加相應量細胞培養液、藥物和7Sea-CCK-8但不加細胞的孔作為空白對照。

Q：只加CCK-8不加細胞的空白孔，數值上增

A：在整個(gè)實(shí)驗過(guò)程中，隨著(zhù)時(shí)間的增加，如果細胞培養時(shí)間較長(cháng)，請注意蒸發(fā)問(wèn)題。因為反應環(huán)境溫度較高，會(huì )有部分液體揮發(fā)?？瞻捉M雖然沒(méi)有細胞，但是隨著(zhù)液體的揮發(fā)，藥物濃度相當于提高了，所以空白對照的數值也會(huì )有輕微的變化（但不會(huì )有明顯的變化）。如果很在意空白對照的數值，可將96 孔板外圍一圈加培養基、水或PBS 保濕。同時(shí)，可以把96 孔板置于培養箱內靠近水盤(pán)的位置以緩解蒸發(fā)。將96孔板外圍兩圈用PBS鋪板，這樣揮發(fā)先揮發(fā)周邊的，可以對內部及空白對照的影響降至最低。

Q：加入CCK8后孵育多久

A：在細胞培養箱內繼續孵育1-4小時(shí)，具體時(shí)間可以通過(guò)預實(shí)驗確定。

Q：一般多久測一次值

A：預實(shí)驗時(shí)可以在0.5、1、2和4小時(shí)后分別用酶標儀檢測，然后選取吸光度范圍比較適宜的一個(gè)時(shí)間點(diǎn)用于后續實(shí)驗。

Q：如何測吸光值

A：用酶標儀測定在450 nm處的吸光值

Q:如果沒(méi)有450nm濾光片，可以選用其他的濾光片嗎

A:若無(wú)450nm濾光片，可以使用420-480nm的濾光片

Q:如果樣品是高渾濁度的細胞懸液，可以使用多大的波長(cháng)測定

A:可以使用大于600nm的波長(cháng)，例如650nm，作為參考波長(cháng)進(jìn)行雙波長(cháng)測定。

Q:加入CCK8后暫時(shí)不測OD值，可以如何處理暫時(shí)保存？能夠保存多久？

A:如果需要暫時(shí)不測定O.D值，可以向每孔中加入10ul 0.1M HCl溶液或者1% w/v的SDS溶液，避光保存在室溫，24小時(shí)內吸光度不會(huì )發(fā)生變化。

Q:CCK8結果怎么處理？有計算細胞活力的公式嗎

A:扣除背景后的數值直接表示細胞活力，如果測藥物的IC50，須用origin等軟件做曲線(xiàn)擬合。

Q:如何制作CCK-8標準曲線(xiàn)？

A:cck8沒(méi)有標準曲線(xiàn)，具體看實(shí)驗內容。

Q:請問(wèn)CCK8測450nnM的OD值用什么時(shí)間點(diǎn)最好？做過(guò)1h，2.5h,4h的時(shí)間梯度，發(fā)現不同時(shí)間點(diǎn)同一樣品其吸光值不一樣而且吸光值的變化趨勢也不一樣。那么OD值在多大的范圍時(shí)比較好呢？這樣好根據吸光值的范圍確定時(shí)間點(diǎn)。

A:OD值在0.3-0.7范圍內做比較好

Q:如何保存

A:7Sea-Cell Counting Kit 溶液在避光、0-5℃的條件下可以保存1 年，若長(cháng)期不用可在-20℃下避光保存2 年。建議分裝后保存于-20℃，使用時(shí)提前于4℃解凍，請避免反復凍融，否則增加背景值，干擾實(shí)驗結果。

Q:需要準備哪些設備及耗材

A:1. 10ul、100-200 ul 以及多通道移液器
   2. 酶標儀（帶有450 nm 濾光片）
   3. 96 孔培養板
   4. CO2 培養箱

Q:培養時(shí)間設定

A:培養時(shí)間根據細胞種類(lèi)的不同和每孔內細胞數量的多少而不同。在正式實(shí)驗前，建議先做預實(shí)驗摸索鋪板的細胞數量以及加入7Sea-Cell Counting Kit 試劑后的培養時(shí)間。

Q:鋪板注意事項

A:鋪板時(shí)請注意保證每個(gè)孔細胞數量均勻，建議鋪板過(guò)程中注意時(shí)?；靹?，防止因細胞沉淀造成不均勻。

Q:混勻

A:加入7Sea-Cell Counting Kit后請前后左右輕輕晃動(dòng)培養板數次，使培養基和7Sea-Cell Counting Kit 溶液充分混勻。

Q:是否需要更換培養基

A:不需要，若藥物影響比較小的情況可以不更換培養基，直接扣除培養基中加入藥物后的空白吸收即可。

Q:待測物質(zhì)有氧化性或還原性該做何處理

A:本試劑盒的檢測依賴(lài)于脫氫酶催化的反應，如果待測物質(zhì)有氧化性或還原性，可在加7Sea-Cell Counting Kit 之前更換新鮮培養基，去掉藥物的影響。
   可在加7Sea-CCK-8 之前更換新鮮培養基，去掉藥物的影響。如果實(shí)驗中有還原劑，請檢查背景的O.D值，即在不含細胞的培養基中加入藥物，然后加入CCK-8試劑在一定時(shí)間內檢測，和不加藥物的培養基進(jìn)行比較（只有CCK-8試劑），如果O.D值明顯偏高，則說(shuō)明有反應。

Q:如果培養基顏色或PH已變化，是否需要更換新的培養基

A:加入7Sea-Cell Counting Kit時(shí)，如果細胞培養時(shí)間較長(cháng)，培養基顏色或pH 值已變化，建議換用新鮮的培養基。

Q:酶標儀檢測前查看有無(wú)氣泡

A:用酶標儀檢測前需確保每個(gè)孔內沒(méi)有氣泡，否則會(huì )干擾測定。

Q:槍頭孔壁殘留誤差

A:用槍頭加樣后更換槍頭。加7Sea-Cell Counting Kit時(shí)可直接加入液面以下，加樣后，前后左右傾斜混合幾次，保證混合均勻

Q:適用細胞

A:因為測線(xiàn)粒體酶，所以真核細胞，有線(xiàn)粒體的均可，例如單細胞，動(dòng)物細胞。但有細胞壁的細胞，例如植物細胞，酵母細胞，底物進(jìn)入細胞效率低，不推薦。

Q:觀(guān)察天數

A:推薦1到2天

Q:吸光值過(guò)高

A:縮短加入試劑后的溫育時(shí)間

Q:參比波長(cháng)

A:實(shí)驗驗證，絕大多數情況下，參比波長(cháng)不是必須的，用空白對照作為零也可以。但是在細胞培養時(shí)間長(cháng)，或者培養有懸浮物，或有其他大顆粒藥物等情況下，可以通過(guò)參比波長(cháng)修正結果（每個(gè)孔里的干擾不一致，參比波長(cháng)可以起到修正的作用）

Q:重復性

A:完全同樣的情況下，測量讀數批間誤差小于1%

Q:線(xiàn)性不佳原因

A:細胞不均；培養液蒸發(fā)；還原劑；氣泡；孔板周?chē)蝗Σ荒苡?，除非只培養少于一天的時(shí)間；細胞數目很重要，太少信號會(huì )低

Q:分散性不好的培養液

A:前后左右來(lái)回傾斜96孔板，使試劑混合充分

Q:晶體析出

A:儲存時(shí)間太長(cháng)；溫度過(guò)低；之前使用后關(guān)閉不嚴或體積太?。ㄕ舭l(fā)），可能會(huì )過(guò)飽和產(chǎn)生析出現象（低于5%的小幾率事件）?？梢栽谑覝鼗旌险鹗?，以助溶解。

Q:金屬毒性

A:可以檢測金屬毒性，最好做空白對照

Q:OD值還可以，但數值跨度太大（波動(dòng)大）

A:數據跨度大須重新設計實(shí)驗。

Q:CCK8與傳統的MTT方法相比有哪些優(yōu)勢

A:1. 7Sea-Cell Counting Kit是用于細胞因子等誘導的細胞增殖檢測，也可以用于抗癌藥物等對細胞有毒試劑誘導的細胞毒性檢測，或一些藥物誘導的細胞生長(cháng)抑制檢測等與細胞活性和增殖相關(guān)的實(shí)驗的一種高靈敏度，無(wú)放射性的比色檢測法。
  2. 7Sea-Cell Counting Kit對細胞無(wú)毒性，可以多次測定選取最佳測定時(shí)間，與MTT 方法相比線(xiàn)性范圍更寬，靈敏度更高。
  3. 7Sea-Cell Counting Kit溶液不需配制，可以直接加入到細胞樣品中，即開(kāi)即用，比MTT 更加穩定，實(shí)驗結果重復性好，適合大規模，高通量的樣品檢測。
  4. MTT 實(shí)驗生成的formazan 不是水溶性的，需要使用DMSO 等有機溶劑溶解；而本方法產(chǎn)生的formazan 是水溶性的，不僅省去了溶解步驟，更因此而減少了該操作步驟帶來(lái)的誤差。

Q:適用于那些細胞？其他還有哪些細胞可用？生物被膜內的活菌（流感嗜血桿菌和綠膿桿菌）

A:所有哺乳動(dòng)物的細胞，細菌一般沒(méi)有檢測CCK8的，可以染色法，或者流式，最常規的方法，有報道， 比濁法測OD600

Q:CCK-8是定性還是定量

A:定量

Q:樣本是不敏感的T淋巴細胞

A:1、細胞鋪板10萬(wàn)/well. 或者預實(shí)驗摸索一個(gè)比較合適的細胞濃度。

   2、cck8不但與細胞數量有關(guān)，還與細胞活力有關(guān)。所以T淋巴細胞雖然不增值，還是能檢測到細胞活力的，但是需要的細胞的數量需要的比較多。

   3、如果藥物處理后直接加cck8檢測，確定藥物有沒(méi)有吸收背景。

   4、實(shí)驗周期比較長(cháng)，在實(shí)驗結束，重新測一下細胞密度，確認細胞數量。

Q:是否可以替代Brud或EDU法檢測細胞增殖

A:雖然CCK通過(guò)檢測對生長(cháng)期的細胞內的脫氫酶來(lái)反應細胞的活性，而胸腺嘧啶插入法通過(guò)核苷酸類(lèi)似物的方式插入合成的DNA來(lái)檢測細胞的活性，這幾種方法是有一定關(guān)聯(lián)性的，CCK可替換胸腺嘧啶插入法來(lái)檢測細胞增殖，并且檢測更方便

Q:懸浮細胞/貼壁細胞分別如何做實(shí)驗

A:懸浮細胞注意別在換液時(shí)候丟失細胞即可。

Q:溶解后的甲臜是在培養液里還是在細胞內

A:甲臢是在培養液中的

Q:如果OD值低，什么原因造成？可以采取什么辦法

A:OD偏低原因1、細胞活力低；2、細胞數量少，可以采取加大細胞數量或者延長(cháng)孵育時(shí)間（最高可以嘗試8小時(shí)）來(lái)解決

Q:設定參比波長(cháng)的目的是什么？必須設定嗎？

A:參比波長(cháng)是為了降低細胞或者96孔板造成的誤差，可以不設

Q:CCK8試劑盒，在檢測的時(shí)候，血清和培養基里的酚紅對檢測結果有沒(méi)有影響

A:無(wú)影響，建議做空白對照

Q:空白孔數值偏高，有可能是培養基長(cháng)菌嗎？或者其他原因？

A:空白孔數值偏高一般認為染菌造成的，很少出現這種問(wèn)題

Q:CCK8能檢測組織嗎

A:不能檢測組織

Q:不是很穩定，重復孔，同樣的處理因素，結果差異有點(diǎn)大，原因？

A:重復孔不穩定主要原因是細胞分配不均勻

Q:是否可以檢測T細胞

A:可以，T細胞長(cháng)的慢，需延長(cháng)孵育時(shí)間

Q:CCK 對照組0.5左右和樣品組0.3左右 OD值都不高

A:建議1、孵育時(shí)間增加一倍；2、細胞數量增加（預實(shí)驗摸條件）

Q:當兩個(gè)細胞混合培養時(shí)（骨髓間充質(zhì)細胞，另一個(gè)是懸浮T細胞），培養一段時(shí)間后，只測骨髓間充質(zhì)干細胞的生長(cháng)、增殖情況，請問(wèn)用CCK-8能測嗎？怎么做？

A:通常測定細胞的生長(cháng)狀況，可以有兩種方法，
   1） 對于懸浮細胞，不換液，直接在培養上清中，按照比例加入CCK-8, 培養一段時(shí)間即可，此時(shí)酚紅的干擾幾乎可以忽略不計，如果有不含細胞的孔，那么可以直接去除背景，所以問(wèn)題不大。
   2）對于貼壁細胞，建議先把培養基和CCK-8按照比例混合，然后換液培養，這樣做的目的是，降低孔間加樣的差異。

對于這兩種細胞的情況，
   1）如果測定貼壁細胞的生長(cháng)狀況，那么可以把懸浮的T細胞轉移掉，使用上述第二種方法測定。
   2）如果T細胞對于間充質(zhì)細胞的生長(cháng)很關(guān)鍵，不能取走，那么測定的活性程度是總量，此時(shí)，需要對每一個(gè)孔的T細胞進(jìn)行估算，如果每個(gè)培養條件下T細胞總量接近，或者T細胞含量很少，遠遠小于間充質(zhì)細胞，也可以測定，使用對照孔可以去除T細胞的影響。
   3）如果T細胞可以短時(shí)間內除去，可以找個(gè)靈敏度高的CCK-8，信號強，建議細胞量合適的情況下（每一個(gè)孔10000個(gè)），30分鐘左右出讀數結果，測定后，可以將T細胞再加入培養孔。 這樣做對細胞的生長(cháng)影響不大。但是如果做動(dòng)力學(xué)，那么要考慮的因素多一些。

Q:耐藥細胞與親本細胞用CCK結果無(wú)差異，是什么原因導致

A:耐藥細胞和親本細胞結果無(wú)差異是實(shí)驗設計的問(wèn)題。選擇合適的藥物濃度或者直接測藥物對耐藥細胞和親本細胞的IC50

Q:應用范圍

A:生物活性因子的活性檢測、大規模的抗腫瘤藥物篩選、細胞增殖試驗、細胞毒性試驗、藥敏試驗、腫瘤放射敏感性測定等

Q:7Sea-Cell Counting Kit是通過(guò)和細胞內的脫氫酶反應而反映著(zhù)細胞數量，假如細胞已經(jīng)死亡，而脫氫酶活性還有，那么如何計算細胞數量？

A:多數情況下，細胞死亡過(guò)程中，細胞內的成分會(huì )降解，脫氫酶會(huì )有部分釋放，但是活性和活細胞比，比較低。舉例說(shuō)：１００個(gè)細胞死亡２０小時(shí)后，釋放的脫氫酶活力，不足５個(gè)活細胞的脫氫酶活力，也就是說(shuō)，這種情況帶來(lái)的誤差５％以?xún)?。而且，這種細胞死亡，對同種細胞來(lái)說(shuō)，情況是一樣的，一般都是在不同的孔間比較同種細胞，所以系統誤差是一樣的，即系統誤差會(huì )彼此消減

Q:試劑盒中有高濃度的1Methoxy PMS的存在，那么毒性怎樣

A:無(wú)須擔心，ＰＭＳ等化學(xué)物質(zhì)很穩定，沒(méi)有揮發(fā)性；高純的的產(chǎn)品，對細胞生長(cháng)是沒(méi)有影響的，而且一般測量細胞生長(cháng)都在生物安全柜中進(jìn)行，對人體而且非常安全。

Q:若每次測定的數值不同是什么原因？如何解決？

A:原則上， 7Sea-Cell Counting Kit在不同試驗中都可以精確反應細胞的數量。如果不同試驗產(chǎn)生偏差，可能是培養基的量、試劑的量有偏差，如果細胞數量一樣，讀數應該是一致的。不過(guò)，測量的讀數不一致，不重要，重要的是線(xiàn)性，換句話(huà)說(shuō)，如果兩次試驗同樣細胞數量讀數有差異，那么這種差異對每個(gè)孔都是一致的，細胞數量5000的讀數降低了10%，那么細胞數量10000的也會(huì )降低10%。
   建議：每次試驗設定內參（陽(yáng)性，陰性和標準曲線(xiàn)），只要標準曲線(xiàn)的線(xiàn)性是一致的，就可以對測量的數值放心。

Q:如何避免某些物質(zhì)對實(shí)驗結果的影響?

A:1）設定陰性對照，每個(gè)孔的本底干擾都減去，保證減去本底后，讀數都是細胞造成的。
   2）做標準曲線(xiàn)，預先知道在可能的干擾物質(zhì)存在情況下，影響有多大。

Q:Cell Counting Kit做藥物刺激兩個(gè)周的實(shí)驗怎么做？

A:首先要保證兩周時(shí)間，細胞數量不會(huì )超過(guò)3萬(wàn)/孔； 先做一個(gè)標準曲線(xiàn)，確定線(xiàn)性范圍； 設置實(shí)驗時(shí)，要有陰性對照(無(wú)藥物）； 每個(gè)顯色的時(shí)間點(diǎn)要統一（比如都是加入CCK8后2小時(shí)讀數）； 建議每個(gè)數據點(diǎn)都要重復3個(gè)孔以上。