Q:膠粒直接

A:平均直徑100微米，比表面積大

Q:結合能力

A:結合大腸桿菌重組GST蛋白（26KD）的能力大于8mg/ml

Q:層析柱參數：最大柱壓

A:0.3Mpa；3Bar

Q:層析柱參數：最大流速

A:  3ml/min（1ml預裝柱）
   15ml/min（5ml預裝柱）

Q:層析柱參數：PH穩定性

A:4~13

Q:破菌緩沖液配方

A:

Q:100*PMSF儲液如何配置及保存

A:1.74g PMSF溶解于100ml異丙醇，-20℃長(cháng)期保存，4℃保存數月，禁止室溫存放

Q:上樣緩沖液如何配置

A:同破菌緩沖液，可以不加PMSF

Q:洗雜緩沖液如何配置

A:在上樣緩沖液中添加還原型谷胱甘肽（GSH）至6-10mM（0.2%）。

Q:超聲

A:以500ml菌體為例，離心收集500ml表達目標蛋白的大腸桿菌，凍融或超聲破菌于20ml破菌緩沖液

Q:上樣前平衡柱子

A:10倍柱體積上樣緩沖液平衡

Q:上樣

A:離心取上清，上樣于預先平衡好的純化柱，通常自然流速可以很好結合。少數情況下，流速過(guò)慢，可以使用硅膠管控制上樣速度

Q:洗柱

A:樣品上完以后，使用上樣緩沖液洗柱10個(gè)柱體積

Q:洗脫

A:洗柱結束以后，使用3-10倍柱體積洗脫緩沖液將目標蛋白洗脫。

Q:實(shí)驗完成后柱子如何處理及保存

A:收集完成以后，使用8M尿素或者6M鹽酸胍5倍柱體積洗柱，再使用大量蒸餾水水洗柱，封閉純化管上下兩端保存在4℃，不要在-20℃凍結。如果長(cháng)期不用，加入20%乙醇保存

Q:是否可以用蛋白酶抑制劑

A:在未知融合蛋白穩定性的情況下，整個(gè)純化過(guò)程最好在4℃完成，可以使用蛋白酶抑制劑防止降解，但是EDTA應當在純化完成以后再加入。此外，可以使用非離子去垢劑改善結合，具體使用濃度參考以下：1% Triton X-100或1% Tween-20或0.03% SDS或0.1% NP-40

Q:一根柱子純化不同蛋白

A:最好用不同的柱子純化不同的蛋白質(zhì)

Q:洗脫液中還原型谷胱甘肽加入量

A:還原型谷胱甘肽具有比較強的酸性，洗脫緩沖液中不要加入量太多，否則會(huì )影響洗脫緩沖液的PH值

Q:能否純化變性蛋白

A:GST親和凝膠只能結合有活力的GST，所以GST親和凝膠不能純化變性蛋白

一、純化不到融合蛋白

1、Q:目標蛋白質(zhì)表達量太低

      A:優(yōu)化密碼子，優(yōu)化表達條件，更換表達載體等方法提高表達量

2、Q:融合蛋白是包涵體

      A:低溫表達，降低誘導時(shí)間等方法促進(jìn)蛋白質(zhì)可溶表達

3、Q:融合蛋白降解

A:4℃條件下純化，加入蛋白酶抑制劑，減少純化時(shí)間

二、純化的蛋白有雜帶

1、Q:融合蛋白有降解

      A:4℃條件下純化，加入蛋白酶抑制劑，減少純化時(shí)間

2、Q:雜質(zhì)蛋白和凝膠有非特異性吸附

      A:上樣緩沖液中加入去垢劑，如1% TritonX-100、1% Tween-20;增加NaCL濃度至0.5M