Q:這種直接PCR試劑盒，擴增產(chǎn)物可以做哪些實(shí)驗

A:PCR的產(chǎn)物可以通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳和EB染色進(jìn)行分析，進(jìn)行下游的常規操作，例如限制性酶切、DNA測序、dHPLC分析等

Q:適用樣品

A:酵母、真菌和霉菌等

Q:模板制備需要多久

A:10min內完成模板制備，無(wú)需DNA抽提，樣品處理快鍵

Q:可以應用于哪些領(lǐng)域

A:1、人類(lèi)、其他哺乳動(dòng)物和鳥(niǎo)類(lèi)基因分析；2、可用于常規檢測：限制性酶切、瓊脂糖凝膠電泳/EB染色、熒光毛細管電泳、DNA測序或dHPLC分析

Q:是否需要去除其他RNA、蛋白等

A:提取的DNA可以馬上用于PCR反應，不需要去除其他蛋白、RNA或者次生代謝產(chǎn)物，滿(mǎn)足快速檢測的需要，特別適合大規?；驒z測

Q:樣品預處理

A:直接挑取單克隆進(jìn)行PCR；或采用簡(jiǎn)單預處理步驟：1、用槍頭或牙簽取單克隆，投入40ul預處理液中，95℃水浴10min，10000rpm離心1min，取1-4ul上清進(jìn)行PCR；2、取酵母培養液，離心，吸除培養基，加入20ul預處理液，煮沸2-3min，取1-4ul樣品進(jìn)行PCR，剩樣保存在-20℃

Q:反應體系

A:以40ul體系示例（20-50ul/reaction），在微量離心管中加入以下各種成分

酵母裂解液	1-2.5ul
聚合酶	1-2ul
5*PCR Buffer	8ul
dNTP（10mM）	0.8ul
Primers	1-2ul（0.25-1uM終濃度）
ddH2O	UP to 40ul

Q:PCR反應參數設置

A:依據擴增產(chǎn)物而定，以2kb的擴增產(chǎn)物為例：94℃ 4 min，35 cycles（94℃ 30 sec，55℃ 30 sec，72℃ 1 min），72℃ 5 min，4℃soak。

Q:我的片段大?。?kb

A:擴增1kb以下片段，30 sec延伸即可；也可采用兩步擴增法（設計引物長(cháng)度22-25bp，68℃退火延伸）

Q:轉化子鑒定

A:鑒定轉化子可以直接挑取單克隆座位PCR模板，但細胞量不能太多，最好控制在10000個(gè)細

Q:裂解液使用量是否有要求

A:聚合酶可以耐受最高10%（V/V）的裂解液，過(guò)量裂解液會(huì )對PCR反應產(chǎn)生抑制并對下游產(chǎn)物分析產(chǎn)生不利影響，大多數情況加入2-5%（V/V）酵母裂解液可以完成PCR反應

Q:如何確認加入模板的最佳范圍

A:初次實(shí)驗，建議加入1%、2.5%和5%（V/V）酵母裂解液

Q:反應為陰性，跟dNTP有關(guān)嗎

A:dNTP容易失效，反應為陰性時(shí)，建議增加dNTP用量，或者更換新鮮制備的dNTP

Q:細菌或霉菌樣品如何操作

A:酵母PCR試劑盒可以用于細菌、霉菌或者其他真菌的免抽提PCR，方法一樣

Q:每次反應多少細胞量

A:本酶靈敏度很高，每次反應500-20000細胞PCR反應最佳