Q:載量

A:膠粒平均直徑100微米，比表面積大，結合大腸桿菌重組His-tag融合蛋白的能力大于20mg/ml。

Q:最大柱壓

A:0.3Mpa;3Bar

Q:最大流速

A:3ml/min（1ml預裝柱）
   15ml/min（5ml預裝柱）

Q:PH穩定性

A:4~13

Q:破菌緩沖液如何配置

A:

Q:100* PMSF儲液如何配置

A:1.74g PMSF溶解于100ml異丙醇

Q:100* PMSF儲液如何保存

A:可-20°長(cháng)期保存，4°保存數月，禁止室溫存放。

Q:上樣緩沖液如何配置

A:同破菌緩沖液，可以不加PMSF

Q:洗雜緩沖液如何配置

A:在上樣緩沖液中添加咪唑至20mM

Q:洗脫緩沖液如何配置

A:在上樣緩沖液中添加咪唑至250mM

Q:關(guān)于緩沖液Tips

A:上述緩沖液為起始緩沖液，目的蛋白質(zhì)不同，可能需要不同的純化緩沖液（如PBS）。具體使用可以參考分子克隆等工具書(shū)或者文獻對緩沖液做修改。也可以根據蛋白質(zhì)性質(zhì)對上述緩沖液做修改，例如：目的蛋白質(zhì)在PH7.4下不穩定，可以在PH7.3-8.3的范圍內對緩沖液的PH調整；250mM咪唑未洗脫下目的蛋白質(zhì)，可以繼續提高咪唑濃度；洗雜蛋白時(shí)候目的蛋白質(zhì)也洗脫，洗雜緩沖液中咪唑濃度降低或者不添加；一些情況下，緩沖液中添加5%-10%的甘油，0.1%的吐溫，0.5M的Nacl會(huì )提高蛋白質(zhì)純化的效果。

Q:破菌

A:以500ml菌體為例：離心收集500ml表達目標蛋白的大腸桿菌，凍融或超聲破菌于20ml破菌緩沖液。這一步可以適當加入PMSF作為蛋白酶抑制劑，但是不能使用EDTA。

Q:上樣前平衡純化柱

A:10倍柱體積上樣緩沖液平衡

Q:上樣

A:離心取上清，上樣于預先平衡好的純化柱（10倍柱體積上樣緩沖液平衡），通常自然流速可以很好結合。

Q:流速過(guò)慢，如何處理

A:少數情況下，流速過(guò)慢，可以使用硅膠管控制上樣速度。

Q:上樣后洗柱

A:樣品上完以后，使用上樣緩沖液洗柱10個(gè)柱體積

Q:如何洗雜

A:使用10-20倍柱體積洗雜緩沖液將雜蛋白從純化柱上洗去，如果雜蛋白太多可以加大洗雜體積。

Q:如何洗脫

A:洗雜結束以后，使用4-10倍柱體積洗脫緩沖液將目標蛋白洗脫。通常目標蛋白會(huì )在第二個(gè)柱體積中開(kāi)始流出。

Q:純化完成后如何處理并保存柱子

A:收集完成以后，使用8M尿素或者6M鹽酸胍5倍柱體積洗柱，再使用大量蒸餾水水洗柱，封閉純化管上下兩端保存在4°C，不要再-20°凍結。如果長(cháng)期不用，加入20%乙醇保存。

Q:哪些情況需要再生

A:鎳親和凝膠可以多次使用，不需要再生。如果需要使用一根柱子純化不同目標蛋白，或者長(cháng)時(shí)間使用金屬離子脫落，雜蛋白沉淀堵塞柱子、流速慢，可以進(jìn)行再生處理

Q:如何再生

A:·用0.1M EDTA洗柱4倍柱體積，將金屬離子洗脫下來(lái)，再用蒸餾水洗柱10倍柱體積除去EDTA殘留。如果柱子堵塞嚴重，使用1% Triton X-100/PBS浸泡過(guò)夜。
   ·使用0.1M鹽酸洗柱4倍柱體積，10倍柱體積蒸餾水沖洗，再用0.1M氫氧化鈉洗柱4倍柱體積，PBS/TBS平衡PH，大量蒸餾水洗柱。這一步需要避免強酸、強堿洗柱時(shí)間過(guò)長(cháng)。
   ·用4%氯化鎳或者硫酸鎳3倍柱體積重新螯合10分鐘，也可以使用4%氯化鈷或者硫酸鈷螯合柱子。
   ·柱子長(cháng)時(shí)間不用，加入20%乙醇，封口后與4°保存，避免干裂或者凍結

Q:不確定蛋白穩定性的情況下，如何防止降解

A:在未知融合蛋白穩定性的情況下，整個(gè)純化過(guò)程最好在4°完成，可以使用蛋白酶抑制劑防止降解，但是EDTA應當在純化完成以后再加入。此外，可以使用非離子去垢劑改善結合，具體使用濃度參考以下：1% Triton X-100或Tween-20或0.03% SDS或0.1%NP-40

Q:還可以通過(guò)哪些方式減少雜蛋白的結合

A:上樣緩沖液中可以含有1mM咪唑減少雜蛋白的結合

Q:洗雜時(shí)目的蛋白脫落

A:部分目標蛋白會(huì )在20mM咪唑洗雜緩沖液中流出，所以對于新樣品，每一步都要留樣電泳，摸索純化條件

Q:蛋白為包涵體，如何實(shí)驗

A:如果融合蛋白是包涵體形式，那么可以選擇變性純化方法，通常是在緩沖液中加入8M尿素以及去垢劑。變性春花時(shí)一定要做好樣品處理，不然容易造成柱子堵塞。變性方法得到的蛋白一般沒(méi)有活力，可以用來(lái)制備抗體，但如想測定活力，就需要做復性。

Q:除了咪唑洗脫，還有其他方法嗎

A:除了常規的咪唑洗脫方法以外，還有EDTA洗脫和PH梯度洗脫。后兩種方法缺點(diǎn)明顯，只在特殊情況下使用。