Q:檢測原理

A:細胞在發(fā)生凋亡時(shí)，會(huì )在生理生化和細胞形態(tài)上發(fā)生一系列變化，在凋亡中晚期，激活的DNA內切酶會(huì )切斷核小體間的基因組DNA，DNA會(huì )被降解成為約180bp-200bp 的片段，而正?；蛘咴鲋臣毎苌侔l(fā)生DNA斷裂。利用這個(gè)差異，用脫氧核糖核苷酸末端轉移酶（TdT 酶）把FITC標記的dUTP標記到斷裂DNA片段的3’-OH 末端，然后進(jìn)行熒光顯微鏡或流式細胞儀檢測，這個(gè)方法被稱(chēng)為T(mén)UNEL(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)法細胞凋亡檢測。

Q:檢測方法

A:熒光顯微鏡或流式細胞儀

Q:樣本類(lèi)型

A:石蠟包埋組織切片、組織冰凍切片、細胞涂片以及細胞懸液

Q:儲存條件

A:試劑盒需儲存在-20℃非無(wú)霜冰箱中，避免反復凍融

Q:固定樣品需要準備什么

A:固定樣品，需自備多聚甲醛

Q:固定懸浮細胞

A:懸浮細胞可用以下方法固定或貼附在玻片上：4°C 緩慢離心（1000rpm）5 分鐘，去除細胞培養上清，并將細胞重新懸浮在4%的甲醛溶液（溶于1×PBS 溶液）使其終密度為1×106/ml，室溫孵育10 分鐘。按照上述方法離心收集細胞，去除固定液并用80%乙醇溶液以相同細胞密度重懸。固定后的細胞可以保存在4°C。固定后的細胞（100-300μl）可直接固定在玻片上，使用聚L-賴(lài)氨酸包被的玻片可以提高細胞的黏附性

一、石蠟包埋組織切片處理流程

Q:如何徹底洗脫石蠟

A:室溫下將石蠟組織切片放入二甲苯中浸泡5 分鐘。更換新的二甲苯再浸泡5 分鐘以徹底脫掉石蠟。

Q:乙醇浸泡

A:室溫下用100%乙醇浸泡切片5 分鐘，更換新的100%乙醇再浸泡5 分鐘

Q:給樣本增加水分

A:室溫下用梯度乙醇（90、80、70%）各浸洗1 次，每次2分鐘，逐漸增加水分

Q:乙醇浸洗后如何處理

A:用PBS 輕輕潤洗切片，并用濾紙小心吸干玻片上樣本周?chē)嘤嗟囊后w。這時(shí)可用石蠟筆或疏水筆在樣品周?chē)枥L樣品分布的輪廓，便于下游透性處理和平衡標記操作。

Q:蛋白酶K如何配置

A:用PBS溶液配置終濃度為20μg/ml的蛋白酶K

Q:蛋白酶K是否可含Dnase活性

A:不可

Q:每個(gè)樣本需要多少蛋白酶K

A:每個(gè)樣本需要100μL 蛋白酶K 溶液

Q:加入蛋白酶K后孵育多久

A:每個(gè)樣本上滴加100μL 濃度為20μg/ml 的蛋白酶K溶液，使其被全部覆蓋，室溫孵育20 分鐘

Q:孵育時(shí)間太長(cháng)會(huì )有何影響

A:嚴格控制孵育時(shí)間，孵育時(shí)間過(guò)長(cháng)可對細胞造成一定的傷害

Q:孵育時(shí)間過(guò)短會(huì )有何影響

A:嚴格控制孵育時(shí)間，孵育時(shí)間過(guò)短可能造成透性處理不充分，影響標記效率。

Q:蛋白酶K工作液的條件是否都一樣

A:蛋白酶K工作液的使用濃度、處理時(shí)間及溫度因組織或細胞的類(lèi)型或固定方法的不同而有所不同，使用者可參照試劑盒提供的標準使用說(shuō)明摸索最合適的實(shí)驗條件

Q:蛋白酶K作用后如何處理

A:用PBS 溶液潤洗樣本三次

Q:如何配置標記反應液

A:

組分比例	1個(gè)樣品	10個(gè)樣品	20個(gè)樣品
FITC-標記反應混合物	48 uL	480 uL	960 uL
TdT 酶（25x）	2 uL	20 uL	40 uL
標記反應液	50 uL	500 uL	1000 uL

Q:標記反應液用不完能否儲存

A:標記反應液應充分混勻，并且一次用完，不能儲存，所以應該酌量配置。

Q:標記前需不需要再處理

A:洗滌樣品一次，輕輕吸干樣本周?chē)木彌_液，注意不要觸碰到樣本

Q:每個(gè)樣本加入多少TdT標記反應混合物

A:在每個(gè)樣本上立即滴加50μl 上述準備的TdT 標記反應混合物

Q:巧用封口膜

A:用預先裁剪好的比樣本稍大的Parafilm?封口膜覆蓋樣本。
注意：可將封口膜折起一角以便于取放。封口膜的使用不僅可以確保反應混合物的均勻分布，也能減少孵育過(guò)程中的液體蒸發(fā)。

Q:標記反應的孵育條件

A:避光，將切片置于濕盒中于37℃孵育60-90 分鐘。

Q:標記反應完成后如何終止

A:移走Parafilm?封口膜，并將切片置于PBS 溶液中室溫孵育1 分鐘

Q:如何降低背景

A:為了降低背景，載玻片在用PBS洗一遍之后，可再用含0.1% Triton? X-100和 2mg/ml BSA的PBS洗三次，每次5分鐘，這樣游離的未反應的標記物可以清除較干凈

Q:PI的使用量

A:滴加50uL PI染色液，在黑暗中室溫放置5分鐘

Q:PI孵育后如何洗滌樣本

A:洗滌樣本，將載玻片浸入去離子水中，室溫放置5分鐘。重復兩次，總共洗三次

Q:檢測前需處理

A:滴干載玻片上多余的水并且用吸水紙擦拭細胞周邊的區域

Q:如何在熒光顯微鏡下檢測

A:立即在熒光顯微鏡下分析樣本，用標準的熒光過(guò)濾裝置在520 ± 20nm的熒光下觀(guān)察綠色熒光，在>600nm下觀(guān)察PI的紅色熒光。

Q:載玻片可以放置多久

A:如有必要，載玻片能在4℃黑暗條件下存放過(guò)夜。

Q:FITC綠色熒光作用對象

A:PI能將凋亡和未凋亡的細胞都染成紅色，只在凋亡的細胞核中才有FITC-dUTP摻入而定位的綠色熒光

Q:結果評斷

A:統計凋亡細胞數和細胞總數并計算出細胞凋亡率。

Q:熒光顯微鏡檢測結果分析

A: 1、PI 濾光片可以用來(lái)觀(guān)察檢測樣本中的全體細胞，所有細胞都呈現紅色熒光，FITC濾光片觀(guān)察樣本，發(fā)出明亮綠色熒光信號的細胞為凋亡細胞，而暗淡或沒(méi)有綠色熒光發(fā)出的區域則為未凋亡細胞或非凋亡晚期細胞。非凋亡細胞由于缺乏大量的3’-OH 末端，因此不會(huì )被顯著(zhù)摻入和標記熒光素基團。
    2、由于凋亡細胞中含有3’-OH 末端的DNA 片段主要集中在細胞核及凋亡小體中，因此可以利用形態(tài)學(xué)分析結合熒光信號來(lái)解釋TUNEL法的凋亡檢測的結果。凋亡過(guò)程中典型的形態(tài)學(xué)改變已經(jīng)被明確確定和廣泛接受，可以用來(lái)作為細胞程序化死亡的檢測指標，并輔助說(shuō)明TUNEL 檢測的實(shí)驗結果。在組織切片樣本中，很難觀(guān)察到胞膜的突起或起泡，許多凋亡細胞的胞核呈現圓形或橢圓形，保存完好的凋亡小體有時(shí)可以觀(guān)察到。由于凋亡是一個(gè)非同步發(fā)生的過(guò)程，組織中的凋亡細胞可能呈散在分布而非像壞死細胞一樣呈連續或成群地分布。

二、組織冰凍切片處理流程

Q:操作流程與石蠟包埋組織切片的有何不同之處

A:該操作流程與石蠟包埋組織切片相似，除了將脫蠟步驟替換為固定和短暫的水化步驟，并將蛋白酶K 的處理時(shí)間縮短到10 分鐘。在進(jìn)行該實(shí)驗檢測前需固定冰凍組織。為了避免在清洗步驟中的樣本在玻片上損失，建議不用洗瓶清洗，而是將玻片浸在PBS溶液中2-3 次進(jìn)行清洗。
注意：在操作中避免樣本干燥?。?！

Q:組織固定與水化

A:1、將玻片浸沒(méi)在4%多聚甲醛溶液（溶于PBS）中，室溫孵育15 分鐘。
   2、輕輕去掉多余液體，并用濾紙小心吸干載玻片上樣本周?chē)囊后w。
   3、將玻片浸沒(méi)在PBS 溶液中，室溫孵育15 分鐘。
   4、輕輕去掉多余液體，并用濾紙小心吸干載玻片上樣本周?chē)囊后w。這時(shí)可用疏水筆在樣品周?chē)枥L樣品分布的輪廓，便于下游透性處理和平衡標記操作。

Q:組織冰凍切片樣本的通透性

A:增加樣本通透性并將蛋白酶K 的處理時(shí)間縮短到10 分鐘，其他同于石蠟包埋組織切片的處理

Q:固定細胞片處理流程

A:該操作流程與冰凍組織切片相似，除了將蛋白酶K 的處理時(shí)間縮短到5 分鐘。將懸浮細胞固定到玻片上的操作請參考“注意事項”章節。為了避免在清洗步驟中的樣本在玻片上損失，建議不用洗瓶清洗，而是將玻片浸在PBS溶液中2-3 次進(jìn)行清洗。注意：在操作中避免樣本干燥

三、流式細胞術(shù)檢測細胞懸液處理流程

Q:流式細胞術(shù)檢測，細胞如何固定

A:1、4°C 緩慢離心（2000rpm）5 分鐘，去除培養上清，PBS 洗滌一次，重新離心收集細胞。
   2、用新鮮配置4%多聚甲醛（in PBS）固定細胞，使其終密度為1×106/ml，室溫孵育10 分鐘。為防止細胞聚集成團，宜在側擺搖床或水平搖床上緩慢搖動(dòng)的同時(shí)進(jìn)行固定，離心收集細胞。按照上述方法PBS重懸洗滌一次，去除固定液并用80%乙醇溶液以相同細胞密度重懸。

Q:固定后的細胞保存條件

A:固定后的細胞可以保存在4°C，可以穩定保存2-6 個(gè)月。

Q:流式細胞術(shù)檢測，如何水化

A:1、將1ml 固定細胞（1×106 cells/ml）轉移到干凈的離心管中。
   2、室溫緩慢離心（1000rpm）5 分鐘，去除乙醇溶液上清。
   3、將細胞重懸在200μl PBS 溶液中。
   4、室溫緩慢離心（1000rpm）5 分鐘，去除PBS 溶液，重復一次。

Q:流式細胞術(shù)檢測，如何增加細胞通透性

A:用含0.1％ Triton X-100和0.2%BSA的PBS重懸細胞，室溫孵育5-10分鐘。

Q:流式細胞術(shù)檢測，如何設立陽(yáng)性對照

A:1、DNaseⅠ溶液配置：3000U/ml或者1mg/ml in PBS, 1mM MgSO4 and 1mg/ml BSA
2、取經(jīng)過(guò)預處理（已完成固定和通透性處理）的細胞，用DNaseⅠ處理，室溫孵育10 分鐘。

Q:流式細胞術(shù)檢測，如何設立陰性對照

A:在配置E中的標記反應液時(shí)，不加TdT酶。

Q:流式細胞術(shù)檢測，配置標記反應液

A:

組分比例	陰性對照	1個(gè)樣品	10個(gè)樣品	20個(gè)樣品
FITC-標記反應混合物	48uL	48 uL	480 uL	960 uL
TdT 酶（25x）	0	2 uL	20 uL	40 uL
標記反應液	加水至50uL	50 uL	500 uL	1000 uL

Q:流式細胞術(shù)檢測，如何標記反應

A:1、PBS洗滌樣品一次。
   2、在每個(gè)樣本加入50μl 上述準備的TdT 標記反應混合物，重懸樣品。
   3、避光，將樣品放置于37℃孵育60 分鐘。

Q:流式細胞術(shù)檢測，終止與結果評斷

A:1、反應完成后，用200uLPBS洗滌1次。
   2、滴加50uL PI染色液，在黑暗中室溫放置5分鐘。
   3、離心，用200uLPBS洗滌樣本，總共洗三次。
   4、立即用流式細胞儀分析樣本。

Q:流式細胞儀如何檢測

A:1、用裝備有488nm 氬離子激發(fā)光源的流式細胞儀檢測標記后的細胞懸液，發(fā)射波長(cháng)是517nm（FITC）和580（PI）?？梢栽O定FITC-PI雙染的細胞和PI單染的細胞比值作為凋亡細胞的比率。
   2、流式細胞儀檢測中光散射參數的改變同樣可以用來(lái)監測和判斷細胞凋亡情況的發(fā)生。例如，未處理的懸浮細胞大多有很高的前向散射值，但誘導出現凋亡后，由于細胞皺縮和膜起泡，側向散射將大大增強。結合光散射參數的改變及TUNEL 標記實(shí)驗的檢測結果，往往可以確定或互相印證用單個(gè)方法得到的結論。

Q:實(shí)驗過(guò)程中，有事暫停實(shí)驗，試劑盒能否暫時(shí)放在冰上

A:試劑盒使用后盡快放回-20℃冰箱保存

Q:TdT酶需注意的溫度條件

A:TdT 酶在-20℃保存時(shí)不會(huì )凝固，不需要提前取出融化，只需在使用前迅速從-20℃冰箱中拿出取用后立即放回-20℃保存

Q:FITC儲存條件

A:FITC-12-dUTP標記混合液對光敏感，避光儲存于–20℃，在標記時(shí)，孵育緩沖液或者包含標記混合物的載玻片要避免光照

Q:是否需要準備其他試劑或溶液

A:如果用于石蠟切片的檢測，需自備蛋白酶K，二甲苯

Q:FITC-標記反應混合物作用

A:FITC-標記反應混合物（FITC-LABELING REACTION MIX）：FITC-dUTP和未標記的dNTP以最佳的比例混合，在末端脫氧核糖核苷酸轉移酶（TdT 酶）的作用下標記DNA 3’-OH 末端

Q:TdT酶作用

A:TdT 酶（TdT ENZYME）：將標記和未標記的脫氧核糖核苷酸摻入斷裂的DNA 3’-OH 末端

Q:PI染色液作用

A:PI染色液：含PI核染料，通過(guò)染色所有細胞的細胞核DNA，從而觀(guān)察樣本中的全體細胞

Q:非特異性熒光，有些細胞或組織， 核酸或者聚合酶活性水平較高，導致出現非特異性的熒光標記

A:取細胞或組織后立即固定，以阻止這些酶導致假陽(yáng)性。

Q:非特異性熒光， TUNEL反應時(shí)間過(guò)長(cháng)，或細胞或組織表面不能保持濕潤，也可能出現非特異性熒光

A:注意控制反應時(shí)間，并確保樣品濕潤。

Q:熒光背景很高，支原體污染。

A:請使用支原體染色檢測試劑盒檢測是否為支原體污染。

Q:熒光背景很高，高速分裂和增殖的細胞，有時(shí)也會(huì )出現細胞核中的DNA斷裂，產(chǎn)生較多3’-OH 末端

A:凋亡晚期檢測，同時(shí)減少TUNEL反應時(shí)間，以提高信噪比。

Q:熒光背景很高，TUNEL反應過(guò)強

A:減少TdT的用量至標準量的20-50%。

Q:標記效率低，樣品固定時(shí)間過(guò)長(cháng)，導致交聯(lián)程度過(guò)高

A:適當減少固定時(shí)間

Q:標記效率低， 熒光淬滅。Fluorescence在普通光照10分鐘就會(huì )嚴重淬滅

A:避光操作

Q:熒光弱是什么原因導致？如何解決？

A:熒光弱第一原因是通透不夠（調整蛋白酶K或者Triton孵育條件，第二原因才是熒光淬滅（注意避光）

Q:石蠟切片樣本中加入蛋白酶K的作用是什么？

A:石蠟樣品（包括冰凍切片）是組織樣品，蛋白酶K的作用是增加通透性，使DNA暴漏

Q:流式細胞術(shù)檢測細胞懸液處理流程。是否包含細胞涂片或貼壁細胞樣本？

A:流式方法檢測適合細胞樣品，可以適用于懸浮細胞或者貼壁細胞消化成懸浮細胞。貼壁細胞或者懸浮細胞固定到玻片上也可以用于熒光顯微鏡檢測

Q:乙醇的作用是什么？梯度乙醇浸洗的目的？

A:石蠟切片用二甲苯脫蠟后，乙醇洗去掉二甲苯，乙醇和水互溶，再用乙醇梯度替換到水中，梯度替換是為了防止切片脫水太劇烈造成脫片或者切片變形

Q:洗滌樣品用什么洗滌？

A:洗滌樣品非特殊說(shuō)明都用PBS

Q:石蠟切片和冰凍切片樣本最后標記反應，我們需要孵育60-90分鐘，有文獻顯示為60分鐘，90min是否時(shí)間太長(cháng)？

A:孵育反應時(shí)間60-90min沒(méi)問(wèn)題。我們也可以直接60min即可

Q:說(shuō)明書(shū)中陽(yáng)性、陰性對照的介紹是在細胞懸液流程中有描述，是否適用所有樣本

A:組織切片也可以用DNAseI做陽(yáng)性對照和不加反應混合物的硬性對照

Q:熒光法與DAB顯色法相比是否有熒光易淬滅的問(wèn)題

A:熒光染料都存在淬滅問(wèn)題，注意避光

Q:Tunel 法檢測凋亡，背景非常高

A:1、可能是Tunel反應過(guò)強或時(shí)間過(guò)長(cháng)---嘗試減少TdT酶的用量，控制反應時(shí)間；
   2、細胞或組織表面要確保濕潤；
   3、樣品包埋或者固定過(guò)程中，方法不當易造成DNA斷裂----改變包埋固定方法；
   4、有可能POD非特異結合----用3% BSA的PBS封閉樣品，室溫10分鐘，或者POD溶液稀釋2-3倍后使用；
   5、內源性POD液可能會(huì )影響背景---在樣品通透處理前，用3%H202的甲醇浸泡樣品10分鐘。

Q:巧用封口膜

A:在標記反應中，推薦使用蓋片或封口膜覆蓋樣本，保證反應液均勻分布，并避免孵育過(guò)程中緩沖液蒸發(fā)損失。準備覆蓋膜時(shí)，可剪下一片Parafilm?封口膜，使其稍大于樣本，并將一角折起便于在接下來(lái)實(shí)驗步驟中取放

Q:濕盒的作用

A:用塑料或玻璃容器及紙巾自制濕盒，在樣本處理過(guò)程中使用濕盒保持樣本環(huán)境的濕潤，一定避免樣本干燥

Q:上流式細胞儀的是否主要針對的是細胞樣本？上熒光顯微鏡的主要是組織樣本？

A:流式只能檢測細胞樣品，顯微鏡可以檢測細胞樣品也可以檢測組織樣品

Q:1次是指一張片子/一個(gè)樣本的意思嗎

A:是的，一個(gè)反應即為一張片子或者50uL細胞懸液

Q:1次反應是指什么

A:1次反應檢測2-5*10的5次方個(gè)細胞的凋亡情況

Q:如何判斷一次反應所需的細胞數量

A:1、用測細胞數量的儀器（儀器較貴10w+）
   2、取1個(gè)樣品，用血細胞計數板數數量
   3、常做實(shí)驗者心里會(huì )有數，在大體范圍內就行

Q:用DAPI替換PI染色組織切片樣本的，區別及優(yōu)缺點(diǎn)？DAPI若自備，配方？觀(guān)察條件？

A:DAPI和PI染核原理一樣，DAPI綠色適合tunel（紅色熒光染料），PI紅色適合tunel（綠色熒光染料如FITC）

Q:切片較厚，是否時(shí)間要加長(cháng)？一般加長(cháng)到多久合適？

A:蛋白酶K反應時(shí)間一般在10~30 min，具體孵育時(shí)間與樣本類(lèi)型、切片薄厚等有關(guān)，一般我們實(shí)驗時(shí)，4um的片子反應10 min，但幾十um的可適當延長(cháng)時(shí)間，如30 min，最終還是要摸索最佳時(shí)間。時(shí)間過(guò)長(cháng)易脫片、過(guò)短起不到通透效果